Summary
Multiple-Cible Le traçage est un algorithme maison développé pour le suivi individuel au sein de molécules marquées de la membrane plasmique des cellules vivantes. Efficacement détecter, évaluer et le traçage des molécules au cours du temps à haute densité de fournir un outil convivial, outil exhaustif visant à étudier la dynamique des membranes nanométriques.
Abstract
Notre objectif est d'obtenir une description complète des processus moléculaires survenant au niveau des membranes cellulaires dans différentes fonctions biologiques. Nous visons à caractériser l'organisation complexe et dynamique de la membrane plasmique au niveau d'une seule molécule, en développant des outils d'analyse dédiés à une particule de suivi (SPT) à haute densité: Multiple-Cible Tracing (MTT) 1. Simple-molécule vidéomicroscopie, offrant milliseconde et nanométrique résolution 1-11, permet une représentation détaillée de 12-14 organisation de la membrane par cartographier de façon précise des descripteurs tels que la localisation cellulaire des récepteurs, la mobilité, l'accouchement ou des interactions.
Nous avons revisité SPT, à la fois expérimentalement et algorithmiquement. Les aspects expérimentaux, dont l'optimisation de configuration et d'étiquetage des cellules, avec un accent particulier sur la densité pour atteindre l'étiquetage le plus élevé possible, afin de donner un aperçu dynamique de la dynamique moléculaires de las il se produit dans la membrane. Questions algorithmiques concernés chaque étape utilisée pour la reconstruction de trajectoires: la détection des pics, l'estimation et la reconnexion, abordés par des outils spécifiques de 15,16 analyse d'image. La mise en œuvre de déflation après la détection permet pics sauvetage initialement masqué par des pics voisins, plus forts. Fait à noter, l'amélioration de la détection influe directement sur la reconnexion, en réduisant les écarts dans les trajectoires. Les performances ont été évaluées à l'aide de Monte-Carlo pour la densité de l'étiquetage différents et des valeurs de bruit, qui représentent généralement les deux limitations majeures pour les mesures parallèles à haute résolution spatiotemporelle.
La précision nanométrique 17 obtenues pour des molécules simples, en utilisant soit successives marche / arrêt optique photocommutation ou non linéaire, peut fournir des observations exhaustifs. C'est la base de méthodes nanoscopie 17 de telle sorte que TEMPÊTE 18, PALM 19,20, 21 ou RESOLFT STED 22,23, which peut souvent exiger des échantillons d'imagerie fixes. La tâche essentielle est la détection et l'estimation de la diffraction limitée pics émanant de simples-molécules. Par conséquent, fournir des hypothèses adéquates telles que la manipulation une précision constante de position au lieu du mouvement brownien, le MTT est carrément adapté pour des analyses nanoscopiques. En outre, le MTT peut fondamentalement être utilisé à n'importe quelle échelle: non seulement pour les molécules, mais aussi pour les cellules ou les animaux, par exemple. Par conséquent, le MTT est un algorithme de suivi puissante qui trouve des applications à l'échelle moléculaire et cellulaire.
Protocol
Dans cette vidéo, nous présentons une pleine expérience unique de suivi des particules, en utilisant quantiques points destinés à un récepteur membranaire spécifique. L'objectif principal de cette expérience consiste à discriminer les différents types de comportements de diffusion moléculaire mesurées au sein de la membrane plasmique des cellules vivantes. En effet, les mouvements moléculaires qui se posent sur la membrane peut généralement s'écarter de la diffusion brownienne en étant linéairement ordonné ou confiné à l'intérieur nanodomaines 26-29, par exemple. Nous visons à la fois à la suite que de nombreux récepteurs que techniquement possible, de donner un aperçu de la variété résultant de la dynamique qui se produisent au sein de la membrane d'une cellule vivante. Ce devrait finalement permettre à déchiffrer les mécanismes qui régulent la signalisation récepteurs de surface cellulaire.
1. Culture cellulaire
- Préparer l'échantillon cellulaire: utiliser adhérentes cellules COS-7, qui expriment le récepteur endogène facteur de croissance épidermique (EGFR) 30. Quandtravailler avec des cellules vivantes sans antibiotiques assurez-vous de ne pas avoir latente sous-détectable de contamination en utilisant les bonnes techniques stériles en tout temps pendant la préparation.
- Cultiver les cellules dans un milieu complet (DMEM avec 10% de sérum de veau, 1% de glutamine, HEPES 1% et pyruvate de sodium à 1%, voir tableau des réactifs spécifiques ci-dessous), à 37 ° C avec 7% de CO 2, en prenant soin de les avoir dans sous-confluente, la croissance exponentielle avant de les répandre dans Lab-Tek.
- Le jour avant l'expérience, répartis 5.000 cellules / puits à 8-bien chambres (Lab-Tek) et incuber pendant la nuit. Comptage des cellules assure une densité constante de cellule, d'où un ratio reproductible quantiques points par cellule.
2. Marquage des cellules
Préparer quantiques points avec un revêtement spécifique. Quantum-points sont des nanoparticules fluorescentes composées de semi-conducteurs. Ces nanoparticules présentent un grand intérêt car ils sont très lumineuses et photostable contre classique31,32 sondes fluorescentes, ce qui permet la réalisation d'un signal approprié à bruit (SNR) pour l'imagerie seule molécule.
- Avant l'expérience, de produire des fragments Fab contre EGFR de la lignée cellulaire hybridome (mAb 108, ATCC HB-9764), par digestion à la papaïne, comme décrit précédemment 21.
- Conjugué Fab avec de la biotine, selon les instructions du fabricant (EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotinylation Kit; Thermo Scientific, figure 1A.).
- Utilisez quantiques points fonctionnalisés avec de la streptavidine (Invitrogen) et émettant à 605 nm (longueur d'onde d'émission optimale pour la brillance, la détection et la séparation de l'autofluorescence cellulaire).
- Préparer la solution de marquage dans un milieu complet (voir le tableau des réactifs spécifiques), afin de saturer les streptavidines présents autour des points quantiques, ainsi que pour prévenir l'agrégation et la liaison non spécifique aux cellules et à la lamelle.
- Préparer deux solutions intermédiaires:un avec quantique points-streptavidine et une autre avec Fab biotinylé, chacun à 20 nM.
- Mélanger un volume égal de ces deux solutions: mélanger les points quantiques avec Fab en ratio 1:1 pour obtenir une concentration finale de travail de 10 nM Fab: quantiques points complexe. En utilisant un ratio équimolaire favorise la formation de mono-fonctionnalisés complexes composées d'un des points quantiques et un fragment Fab biotinylé. Cela favorise l'étiquetage monovalent, limitant les observations des artefacts dus à des récepteurs de réticulation 33,34.
- Incuber pendant 15 minutes à 25 ° C, en utilisant un agitateur à 1200 rotations par minute pour empêcher l'agrégation. Le mélange est alors prêt à être utilisé sur des cellules vivantes.
- Incuber les cellules dans 100 ul de mélange pendant 5 minutes à 37 ° C avec 7% de CO 2.
- Laver les cellules avec le milieu de l'imagerie non-autofluorescente (tampon HBSS, HEPES 1%, voir tableau des réactifs spécifiques) pré-chauffé à 37 ° C.
- Retirez délicatement l'excédent des étiquettes pour éviter des Nations Uniesnécessaire de gâcher le SNR par non liée, de mise au point quantique-points, par beaucoup laver chaque puits avec du milieu de l'imagerie, typiquement 5 fois à la température ambiante, avec au moins 5 minutes de retard avant le dernier lavage.
3. Configuration optique
La configuration vidéo-microscopie est composé de quatre grandes parties:
- Un microscope inversé avec un cube fluorescence spécifique (FF01-457/50 d'excitation, FF495-DI02 dichroïque, et FF01-617/73 filtres d'émission, Semrock) et une ouverture numérique élevée (1.3 ou 1.49) à immersion 100x objectif.
- Un 100 W à lampe au mercure (couplée à la microscopie par une fibre optique, en évitant interférer avec la thermorégulation).
- Un 512 x 512 pixels de sensibilité EMCCD appareil afin de réaliser une suffisante SNR.
- Un incubateur pour conserver les échantillons biologiques à 37 ° C pendant l'expérience.
4. Acquisition
- Sélectionnez les cellules isolées et le bien-propagation. Cettefavorise l'extension de la belle, lamellipodes plat, la mieux adaptée à regarder pour un mouvement planaire des molécules membranaires.
- Évaluer l'état physiologique cellulaire par son aspect à la fois en lumière transmise et la fluorescence: le trafic vésiculaire intense, absence de signes nécrotiques ou apoptotiques, une autofluorescence faible, et la moyenne-forte en matière d'étiquetage des points quantiques (typiquement jusqu'à 1000 points quantiques par cellule, voir Fig. 1B, C).
- Sélectionnez une densité élevée d'étiquetage, ce qui est essentiel pour la surveillance simultanée des récepteurs autant que possible. Ceci est en fait limité à la fois par des facteurs physiologiques (expression à la surface, l'accessibilité épitope, mouvement latéral) et les paramètres algorithmiques (non-cumul des fonctions d'étalement de point (PSF), même en tenant compte flou dus au mouvement, pour permettre une bonne détection et la reconnexion).
- Pour chaque cellule, d'abord acquérir une image de champ clair (de préférence en utilisant DIC, si elle est disponible) qui peuvent en outre permettre la vérification de l'aspect des celluleset les limites spatiales de l'lamellipodes.
- Sauvegarder cette image en utilisant le même nom que la vidéo-pile (comme cell1.tif & cell1.stk par exemple), dans un sous-dossier nommé dic, puisque, avec ces conventions, l'algorithme peut automatiquement retrouver l'image correspondante pour les chaque pile.
- Acquérir de 1 à 3 vidéos par cellule, en permanence, généralement à 36 ms taux, le taux le plus rapide possible en plein cadre avec cet appareil photo. Cependant, on peut acquérir à des fréquences plus élevées, jusqu'à 1 ms taux, à l'aide CCD dédié avec une sensibilité accrue et / ou moins de pixels. La technologie de transfert de trame fournit retard négligeable entre les images.
- Amélioration se multiplient électronique doit toujours être réglé au maximum (juste en dessous de la saturation, le cas échéant) afin de permettre d'atteindre la sensibilité seule molécule, avec un nombre suffisant de SNR, au moins au-dessus de 20 dB (pour la détection de pointe efficace 1), généralement autour de 25-30 dB.
- Typiquement acquérir 300 images par vidéo, le péchétrajectoires sexies sont reconstruits plus de ~ 100 images en moyenne, pour la plupart limités par de longues événements clignotantes. La fréquence vidéo et la longueur peut être adaptée pour une mesure donnée, ce qui pourrait nécessiter plus de traces, par exemple.
5. Analyse MTT
- Sélectionnez le chemin vers le répertoire contenant les fichiers vidéo d'évaluer un ensemble de données avec Matlab ou Octave.
- Pour commencer l'analyse entièrement automatisée 1,35, tapez la commande detect_reconnex23 dans Octave, ou MTT23i dans Matlab. Ce programme est pour "la version 2.3, avec une interface utilisateur" et est disponible pour téléchargement, avec la version précédente 2.2. Il affiche d'abord une interface graphique liste de tous les paramètres utilisés, comme indiqué dans la Fig. 2.
6. Les résultats représentatifs
MTT analyse automatiquement chaque enregistreur vidéo, de livrer des traces de cibles détectées et estimées, complétées par d'autres dansvestigations, tels que la détection de confinement. Cela permet en fin de compte des traces de cartographie sur les images de cellules (Fig. 1C & 3).
Description de MTT
L'analyse MTT coeur est effectuée sur chaque trame, en invoquant 3 tâches principales (Fig. 3):
- Détection de la présence ou l'absence d'une cible (points quantiques), dans un coulissement sous-région successivement centrée autour de chaque pixel, où deux hypothèses sont comparées: présence soit d'un signal, avec la PSF modélisé comme un pic gaussien bidimensionnel , ou seulement du bruit, en utilisant un seuil assurant alarme de basse assez fausse, à moins d'un parasite de détection par image. Cela conduit à une carte de probabilité de détection. Chaque maximum local est considéré comme une cible putative, assurant que son niveau de probabilité est supérieure à une valeur minimale, fixé en fonction de la probabilité de fausse alarme souhaitée (PFA). Cette limite est fixée assez bas pour discriminer efficacement signaux de bruit, en évitant au mieux les détections parasites (PFA de 10 -6 par défaut, pour assurer au moins une erreur dans 512 x 512 pixels des images), tout en permettant une probabilité suffisamment élevée de détection, pour atteindre le 1 prédite théoriquement optimale. Notez que l'exigence d'utiliser une sous-région implique que les bords de l'image (3 pixels, pour une fenêtre par défaut de 7 x 7 pixels) ne peut pas être évalué.
- Estimation, pour chaque cible détectée, des paramètres pertinents, tels que sous-pixel de position et l'intensité du signal. Pour chaque cible détectée, une des moindres carrés de Gauss-Newton ajustement est ensuite effectuée pour estimer la position, la largeur et la hauteur de la gaussienne détecté. Ceci fournit notamment la position de sous-pixel du colorant (10 à 20 nm pour la précision des valeurs SNR typiques et des colorants immobiles ou lentement diffusant, croissant jusqu'à environ 100 nm pour les colorants de diffusion à 0,1 um 2 / s).
- Reconnexion des nouveaux objectifs avec letraces déjà construites au cours des trames précédentes. L'ensemble de nouvelles cibles est identifié avec l'ensemble des traces précédentes. A cet effet, afin d'attribuer à chaque cible à une trace, si possible, toutes les informations statistiques disponibles obtenu à l'étape de détection est utilisé, non seulement la position, mais aussi l'intensité, la largeur, de clignoter et les statistiques associées. Par conséquent, les objectifs ne sont pas seulement affecté à la plus proche de trace: en cas de traces de passage, l'intensité, la vitesse, la largeur et clignotants seront pris en considération. Cette offre le score de reconnexion statistiquement optimale. Cette stratégie permet d'éviter, si possible, de polarisation de la reconnexion à l'égard des plus proches voisins.
Pics détectés peuvent être a posteriori rejetée si leur estimation ou reconnexion échoue. Un test spécial s'occupe de la détection de nouveaux sommets, ce qui lancerait de nouvelles traces. Ce test utilise une plus stricte PFA (10 -7), depuis un pic reconnecter à une trace peut être interprété de facto comme un o de validation f sa pertinence (ce critère étant par définition ne s'applique pas à de nouveaux sommets).
Analyse de la trajectoire
Possible confinement transitoire est ensuite évalué par une fonction inversement proportionnelle à la diffusion locale 24-29. L'application d'un seuil permet de définir confinés ou non épisodes. En itérant ces cours toutes les traces, nous pouvons cartographier la dynamique des membranes, en termes de confinement transitoire / ralentir les événements. Cela peut être alternativement représentés en utilisant le binaire ou les valeurs discrètes de cet indice de confinement.
Par défaut, MTT effectue automatiquement ces travaux, pour économiser 8 paramètres de pointe dans un fichier texte: numéro de châssis, i et la position j, l'intensité du signal, le rayon, le décalage et cligner des yeux, pour chaque trame vidéo (groupe de 7 lignes) et trace (colonne) . Ces paramètres de sortie peuvent être rechargées dans Matlab ou Octave en utilisant le script fread_data_spt pour approfondir l'analyse des traces ou des intensités de signal soit, comme en témoigne la "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt" script> MTT_example en annexe.
D'autres analyses conduisent à la carte des traces sur chaque cellule (Fig. 1C & 3) et à assurer une distribution d'histogramme pour les paramètres pertinents (tels que l'intensité des pics, SNR ou des valeurs de diffusion locales). Pour chaque fichier, la moyenne et l'écart-type de chaque paramètre sont enregistrées dans un fichier texte, avec une image des histogrammes. Distributions logarithmiques, tels que des déplacements carrés r 2, conduire à la moyenne géométrique. Le coefficient de diffusion D est calculée à partir d'un ajustement linéaire au cours des cinq premiers points de la courbe des TMS. Ces valeurs donnent un aperçu d'une expérience impliquant pour la cinétique de réactions cellulaires par exemple ou des traitements pharmaceutiques / enzymatique affectant l'organisation des membranes. Depuis MTT est un code open-source, cet aspect peut être facilement adaptée à toute enquête dédiée.
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Figure 1. Surveillance dynamique des récepteurs membranaires par MTT. Composants de la membrane (A), comme l'EGFR, sont étiquetés avec des points quantiques couplés à des fragments Fab biotinylé (dessin schématique avec mise à l'échelle à peu près correcte de chaque molécule). (B) typique image fluorescente acquise à partir d'un direct cellule COS-7, avec le temps d'exposition de 36 ms, représentant limité par diffraction des pics correspondant à des récepteurs individuellement étiquetés. (C) de sortie de l'analyse MTT affichage des trajectoires reconstituées des récepteurs, des superposées sur l'image en fond clair de la cellule.
Figure 2. Paramètres d'entrée MTT. Exécution MTT23i ouvre une interface utilisateur graphique liste de tous les paramètres d'entrée, les noms et les valeurs par défaut, tel que décrit dans notre publication précédente 1. Dans les paramètres de l'algorithme, l'espace et le temps (fenêtres de recherche, le rayon de pointe, la diffusion maximale et clignotant) sont en dimension standard, les unités pixels et des cadres. Calibrages peuvent être appliquées a posteriori pour convertir les résultats de sortie. Les valeurs par défaut, correspondant à une 512BFT Cascade avec un grossissement de 100x, sont la taille des pixels: 156 nm / pxl et de retard de trame: 36 ms / frame.
Les enquêteurs devraient optimiser quelques paramètres critiques, tels que le coefficient de diffusion maximale prévue ("Diff max") et un maximum de disparition clignote ("T off"). Ces deux limites spatiales et temporelles sont presque les seuls qui ont besoin d'être reconsidérée pour une condition donnée expérimentale, les autres étant des valeurs par défaut robustes. Par exemple, le nombre de fausses alarmes est directement réglé pour assurer moins d'une erreur pour un million de pixels, donc moins d'un par image, ce qui est satisfaisant dans la plupart des cas. Tous les paramètres sont sauvegardés dans un fichier texte dans le dossier de sortie, permettant aux utilisateurs de vérifier a posteriori les paramètres ont été utilisés pour l'analyse.
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Figure 3. Les principales étapes de l'analyse MTT. Partir d'une pile expérimentale d'images de fluorescence, les pics sont séquentiellement et automatiquement détectés, estimée par un ajustement gaussien et reconnecté sur des trames (première gamme d'opérations, la partie supérieure de l'organigramme). Les traces peuvent encore être analysés pour l'accouchement présumé, par exemple, conduisant finalement à une carte dynamique de descripteurs pertinents (deuxième gamme d'opérations, la partie inférieure).
Figure 4. Valence d'étiquetage n'a pas d'incidence MTT. Pour évaluer le biais possible introduit par l'étiquetage polyvalent artéfactuelle, l'analyse MTT a été réalisée pour suivre l'EGFR endogène étiquetés en utilisant 2 systèmes différents, pour générer et analyser des cartes de trajectoires. (A) Récepteur ont été marqués avec biotinylé Fab et quantique dots605-streptavidine, tel que décrit dans le protocole.Dans ce cas, la valence de multi-quantique-points et streptavidines peut entraîner dans le couplage de plusieurs récepteurs à un seul colorant. (B) Récepteur ont été marqués avec Fab directement couplé à un colorant organique, Atto647N. Dans ce cas, un fragment Fab, d'où un récepteur, peut être couplé à plus d'un colorant. (C) Carré moyen de déplacement (TMS) la courbe a été calculée pour toutes les traces pour chaque cellule, étiquetés, soit avec des points quantiques ou des colorants ATTO (graphiques gauche et droite, respectivement). Les coefficients de diffusion ont été calculés par régression linéaire sur les cinq premiers points de la MSD (ligne rouge pointillée). Chaque régime d'étiquetage conduit à des valeurs de diffusion similaires (graphique central). Qdot: quantique dots605 (n = 5 cellules), Atto: Atto647N (n = 7 cellules), ns: non significatif (test t de Student valeur p> 0,05).
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Discussion
Dans une particule de suivi, à côté des éléments de cellules et la microscopie, l'analyse représente une partie substantielle de l'ouvrage. Cela répond à l'algorithme utilisé pour effectuer les trois tâches principales: la détection, l'estimation et la reconnexion des pics sur chaque trame. Mais l'aspect conséquente de ce travail réside dans l'élaboration de l'algorithme lui-même, qui peut être adapté pour toute nouvelle enquête dédiée, essentiellement pour les dernières, les étapes supplémentaires (tels que le déchiffrement des modes de mouvement, les interactions ou la stœchiométrie).
Cependant, une fois l'algorithme est complètement développé, en cours d'exécution, il est simple, surtout depuis que nous avons accordé une attention à maintenir le nombre de paramètres d'entrée au minimum (Fig. 3). Cela rend MTT très robuste et facile à mettre en œuvre. Lors de l'élaboration MTT, nous avons cherché à reconsidérer entièrement les options d'analyse utilisées pour chaque tâche. Nous avons voulu optimiser le processus le long de deux axes difficiles:
- Traiter l'espritdensités élevées de l'étiquetage h fournit des informations détaillées sur l'espace en terme de surface de la cellule d'échantillonnage. Idéalement, il faudrait essayer de suivre une population de près de moléculaire complète simultanément, afin d'obtenir une observation complète. Cependant, une telle étiquetage exhaustif mènerait à une image semblable à celle obtenue classiquement par immunofluorescence, sans une seule molécule de la résolution, puisque toutes les étiquettes se chevauchent fortement dû à la diffraction. Pour le numéro moléculaire typique (c.-à-~ 10 5 récepteurs par cellule 30) et la taille des cellules (soit ~ 30 um), si nous supposons une distribution homogène, la moyenne inter-molécule distance est ~ 100 nm. Diffusion lors de l'acquisition contribue également à la diffusion de la PSF d'une ampleur comparable: typiquement ~ 100 nm pour le mouvement brownien à 0,1 um 2 / s pendant 30 ms. Il convient de noter, cet étalement est isotrope en moyenne et génère donc encore un PSF gaussienne. Ainsi, jusqu'à 10% de la population pourrait théoriquement être détectée, car cela lead pour une distance moyenne d'environ 300 nm, compatibles avec les limites de diffraction et de mouvement. Cependant, ceci doit être modulé en tenant compte de inhomogénéité dans la distribution spatiale, l'étiquetage des limitations (telles que les contraintes stériques, l'accessibilité épitope, etc), l'augmentation, voire des conflits insolubles en raison de trajectoires de passage, et de l'efficacité de détection global. Expérimentalement, nous pourrions atteindre et suivre avec précision une fraction importante de la population globale, avec des densités de ~ 1000 étiquettes au sein d'un champ de vision de 80 um de largeur. Il en résulte limite supérieure d'un compromis entre la nécessité pour les détections individuelles et l'objectif d'une mesure exhaustive du territoire (voir Fig. 1C pour apprécier l'échantillonnage spatial de la surface des cellules).
- Manipulation de la plus faible possible SNR permet d'imagerie, soit à un éclairage faible, ce qui est bénéfique pour les cellules de viabilité, et / ou à haute vitesse, qui fournit de meilleures informations temporelles. Toutefois, cela implique moins de signauxpar image, en raison de diminution du nombre de photons collectés. Notez que le plus court possible le calendrier par les caméras EMCCD (1 ms) semble correspondre à la plus faible SNR acceptable (20 dB) pour la détection et de bien estimer par MTT.
Étiquetage valence est une question récurrente dans les études de molécules simples. En effet, la mesure directe du rapport colorant / cible est très difficile 34. Cependant, une autre façon d'enquêter sur la partialité supposée introduite par l'étiquetage polyvalent artéfactuelle consiste à comparer les mesures avec soit points quantiques balises (avec des objectifs putativement plusieurs fois par un colorant, induisant réticulation artéfactuelle) ou organiques (colorants étiquettes avec, au contraire, colorants putativement plusieurs par cible, l'intensité du signal de polarisation et de blanchiment seulement les caractéristiques). Nous et d'autres 6,36,37 a observé un comportement comparable lors de l'utilisation soit quantiques points ou des colorants organiques (atto647N dans notre cas, Fig. 4), en termes de diffusion et de la transition entre les moisdes de mouvement. Variation des valeurs de diffusion entre les deux conditions est inférieure à la disparité cellule à cellule (figure 4C). Cela montre que la valence étiquetage, même s'il n'est pas strictement monovalent, n'affecte pas significativement les résultats du SPT.
Confinement et interactions moléculaires
Confinement transitoire ou stable peut être interprété comme la signature de l'affinité préférentielle ou de l'interaction 24-29. Biomembranes sont en effet fortement inhomogène, avec des assemblées locales dictées par des caractéristiques structurelles telles que l'hydrophobie, la taille transmembranaire et la tension interfaciale. Ces forces motrices conduire à un remodelage spatio-temporelle des ensembles fonctionnels avec des rôles cruciaux pour savoir de signalisation, d'adhérence ou de la traite. La cartographie et la quantification de ces événements est censé fournir une clé pour déchiffrer la façon dont une cellule intègre des stimuli présentés en permanence. En effet, pour une cellule, présentant une adaptation adéquate à travers une req réponse préciseuires tuning interactions entre les partenaires de signalisation et de leur environnement. Les récepteurs membranaires peuvent interagir soit avec des clôtures le cytosquelette sous-membranaire, les structures membranaires tels que les fosses d'endocytose ou des adhérences focales, ou encore des partenaires protéiques / lipides, impliqués dans la signalisation domaines, par exemple. Dans notre représentation, de tels événements peuvent être étudiés grâce à la force de confinement et de ses variations au fil du temps et l'espace. Cela renforce encore l'importance de travailler au plus haut niveau possible résolution spatio-temporelle, en gardant à l'esprit les contraintes associées à des timings de courte durée et des densités élevées, comme nous le verrons ci-dessus.
Techniques complémentaires
Il est une bonne pratique de comparer ces mesures dynamiques avec d'autres approches. Par exemple d'autres techniques de microscopie dynamique, comme le FRAP et FCS, une sensibilité et une résolution complémentaire 4,38,39. FRAP fournit une mesure ensemble de la diffusion moléculaire, tandis que FCS peut atteindre sIngle-molécule de sensibilité, avec une résolution très bon moment. Toutefois, les deux méthodes sont intrinsèquement limitée à une mesure locale (en général dans un endroit confocale). Ce qui nous a motivés à prendre l'avantage et repousser les limites des possibilités spatiales de SPT:. Une enquête sur un grand champ de vue, pour englober une cellule entière à la fois, avec une précision d'intérêt local spatio-temporelle
Développements ultérieurs et des enquêtes
Selon la gamme de questions biologiques qui peuvent être abordés à l'aide d'une seule molécule mesures, MTT peut être étendue le long de directions différentes, à chaque niveau: détection, estimation, la reconnexion et d'autres analyses. Par exemple, on peut envisager de traiter avec plus d'une population moléculaire, appelant à la détection multicolore - comme on peut être effectuée en utilisant les régimes dédiés optiques ou analytique. L'estimation peut inclure de nouveaux descripteurs pertinents, tels que toute l'information spectrale ou de polarisation, ou l'axialesposition z, pour étendre le traçage en 3D 40.
Pour la reconnexion, les hypothèses browniens et clignotant peut être entièrement reconsidérée pour un problème spécifique. Est intéressant, c'est d'une seule molécule des mesures ont été étendues au cours de la dernière décennie pour le régime soi-disant nanoscopique 17,22,23. Bien que le MTT est s'adressant directement à molécule unique de localisation, il est d'une importance cruciale pour examiner le cas d'un échantillon fixe, qui fournit une solution sûre pour une localisation exhaustive d'une population moléculaire. Toutefois, dans un tel cas, l'hypothèse brownien n'est plus valide. Son remplacement par une mesure précise de manutention nanoscopique, seulement limité par SNR, est essentielle pour parvenir à la meilleure résolution nanométrique.
Le long de ces développements, sur la base soit multicolore, 3D et / ou des mesures exhaustives, les travaux futurs devraient offrir une vue d'ensemble de la biologie moléculaire des données statiques et dynamiques. Cela aura un effet direct relevment pour les études de biologie cellulaire, tels que le déchiffrage des modalités subtiles de régulation de signalisation supplémentaires et intracellulaire.
Téléchargement MTT
Le code source de MTT est disponible en tant que logiciel open-source pour la recherche universitaire. Il peut être téléchargé à partir de notre page web, à ciml.univ-mrs.fr , en accédant à la page de notre équipe, il & Marguet Lab, qui fournit un lien pour la description du logiciel et le téléchargement. S'il vous plaît noter que nous vous demandons votre nom et votre seule institution pour plus d'informations, par exemple en cas de poursuite de la collaboration ou de vous informer sur une nouvelle version ou mise à jour.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous remercions les membres de notre équipe, en particulier Blache MC pour l'assistance technique, ainsi que M et B Irla Imhof, pour leur soutien et des discussions fructueuses. Les chiffres de la déflation et le confinement reproduit avec la permission de Nature Methods. Ce projet est soutenu par des subventions institutionnelles du CNRS, l'INSERM et l'Université de Marseille, et par des subventions spécifiques de la Région Provence-Alpes-Côte-d'Azur, l'Institut National du Cancer, l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-CPV- 0034-02, l'ANR 2010 BLAN 1214 01) et la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Equipe labélisée-2009). VR est soutenu par une bourse de la Ligue Nationale contre le cancer Contre le.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
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| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
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| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
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| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
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| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
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| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
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