Summary
Multiple-Target-Tracing ist ein Algorithmus für die Verfolgung von hausgemachten individuell markierten Moleküle in der Plasmamembran von lebenden Zellen entwickelt. Effiziente Erfassung, Abschätzung und Tracing-Moleküle im Laufe der Zeit bei hoher Dichte bieten eine benutzerfreundliche, umfassende Werkzeug, um nanoskalige Membran Dynamik zu untersuchen.
Abstract
Unser Ziel ist eine umfassende Beschreibung der molekularen Vorgänge bei zellulären Membranen in verschiedenen biologischen Funktionen zu erhalten. Unser Ziel ist die Charakterisierung der komplexen Organisation und Dynamik der Plasmamembran auf Einzel-Molekül-Ebene, durch die Entwicklung von Analysewerkzeugen gewidmet Single-Particle Tracking (SPT) in hoher Dichte: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Einzel-Molekül-Videomikroskopie und bietet Millisekunde und Auflösung im Nanometerbereich 1-11, erlaubt eine detaillierte Darstellung der Membran Organisation von 12-14 genau Mapping-Deskriptoren wie Zell-Rezeptoren-Lokalisierung, Mobilität, Gefangenschaft oder Wechselwirkungen.
Wir revisited SPT, sowohl experimentell als auch algorithmisch. Experimentelle Aspekte waren die Optimierung Setup-und Zell-Kennzeichnung, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Erreichen der höchstmöglichen Dichte Kennzeichnung, um eine dynamische Momentaufnahme der Molekulardynamik einen gebens tritt es innerhalb der Membran. Algorithmische Fragen betroffenen einzelnen Schritte für den Wiederaufbau von Flugbahnen verwendet: Spitzen-Erkennung, Einschätzung und der Wiederanschluss von speziellen Werkzeugen aus Bildanalyse 15,16 gerichtet. Implementieren von Deflation nach Entdeckung ermöglicht Rettung Gipfel zunächst von benachbarten, stärkeren Peaks versteckt. Zu beachten ist, wirkt sich direkt auf die Verbesserung der Erkennung Wiederverbindung, durch Reduzierung der Lücken innerhalb Flugbahnen. Vorstellungen wurden ausgewertet mit Hilfe von Monte-Carlo-Simulationen für unterschiedliche Kennzeichnung Dichte und Noise-Werte, die in der Regel stellen die beiden wesentlichen Einschränkungen für parallele Messungen bei hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung.
Die Nanometergenauigkeit 17 für einzelne Moleküle erhalten, unter Verwendung von entweder aufeinanderfolgenden Ein / Aus Photoschalten oder der nichtlinearen Optik, liefern kann, flächendeckende Betrachtungen. Dies ist die Grundlage von Nanoskopiemethoden 17 wie Sturm 18, PALM 19,20, 21 oder RESOLFT STED 22,23, which erfordert häufig den Imaging-fixierten Proben. Die zentrale Aufgabe ist die Erkennung und Einschätzung der beugungsbegrenzten Spitzen ausgehend von Single-Moleküle. Daher angemessene Annahmen wie z. B. Umgang mit einer konstanten Positionsgenauigkeit anstelle der Brownschen Bewegung, wird MTT unkompliziert für nanoskopische Analysen geeignet. Ferner kann MTT grundsätzlich in jedem Maßstab verwendet werden: nicht nur für Moleküle, sondern auch für Zellen oder Tiere, zum Beispiel. Daher ist ein leistungsfähiges MTT-Tracking-Algorithmus, der Anwendungen findet auf molekularer und zellulärer Skalen.
Protocol
In diesem Video stellen wir eine vollständige Single Particle Tracking Experiment, mit Hilfe von Quanten-Dots gezielt an eine bestimmte Membran-Rezeptor. Das Hauptziel dieser Versuch besteht darin, diskriminierende verschiedene molekulare Diffusion Verhalten in der Plasmamembran von lebenden Zellen gemessen. Tatsächlich können molekulare Bewegungen, die durch an der Membran typischerweise Brownsche Diffusion abweichen, die linear gerichteten oder geschlossenen in Nanodomänen 26-29, zum Beispiel. Wir zielen darauf ab, gleichzeitig nach so vielen Rezeptoren wie technisch möglich, um einen Schnappschuss von der Vielfalt, die sich in der Dynamik, die innerhalb der Membran einer lebenden Zelle liefern. Dies wird letztlich zu erwarten, damit Entschlüsselung der Mechanismen, die Zelloberflächen-Rezeptor-Signalisierung.
1. Cell Culture
- Bereiten Sie die zelluläre Probe: verwenden adhärenten COS-7-Zellen, die endogen exprimieren den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) 30. WannArbeit mit lebenden Zellen ohne Antibiotika sicher kein latentes Sub-nachweisbare Verunreinigungen durch Verwendung geeigneter steriler Techniken zu jeder Zeit während der Vorbereitung haben zu machen.
- Kultivieren von Zellen in vollständigem Medium (DMEM mit 10% Kälberserum, 1% Glutamin, 1% HEPES und 1% Natriumpyruvat, siehe Tabelle Reagenzien unten), bei 37 ° C mit 7% CO 2, wobei dafür, dass sie haben subkonfluenten, exponentielles Wachstum bevor sie sich ihnen in Lab-Tek.
- Am Tag vor dem Versuch, zu verbreiten 5.000 Zellen / Well in 8-well Kammern (Lab-Tek) und über Nacht. Zählen von Zellen sorgt für eine konstante Zelldichte, damit eine reproduzierbare Verhältnis von Quanten-Punkten pro Zelle.
2. Zellmarkierung
Bereiten Quanten-Punkte mit einer speziellen Beschichtung. Quantum-Dots sind fluoreszierende Nanopartikel von Halbleitern. Diese Nanopartikel stellen eine hohe Interesse, da sie sehr hell und photostabil sind im Vergleich zu klassischenFluoreszenzsonden 31,32, die Erreichung eines entsprechenden Signals erlaubt es, Rauschabstand (SNR) für Single Molecule Imaging.
- Vor dem Experiment, Fab-Fragmente zu erzeugen gegen EGFR aus Hybridom-Zelllinie (mAb 108, ATCC HB-9764), durch Verdau mit Papain, wie zuvor 21 beschrieben.
- Konjugat Fab mit Biotin, als den Anweisungen des Herstellers (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylierungskit; Thermo Scientific, 1A.).
- Verwendung Quanten-Punkte mit Streptavidin (Invitrogen) und Emission bei 605 nm (optimale Emissionswellenlänge für Glanz, Detektion und Abtrennung von zellulären Autofluoreszenz) funktionalisiert.
- Bereiten Sie die Lösung zur Kennzeichnung in vollständigem Medium (siehe Tabelle der Reagenzien), um die vorliegenden Streptavidine um die Quanten-Punkte sowie eine Aggregation und nicht-spezifische Bindung an die Zellen und auf das Deckglas zu verhindern sättigen.
- Bereiten Sie zwei Zwischen-Lösungen:ein mit Quantum-Dots-Streptavidin und ein weiteres mit biotinylierten Fab, jeweils bei 20 nM.
- Mischen Sie das gleiche Volumen dieser beiden Lösungen: Mischen Sie die Quantum-Dots mit Fab im Verhältnis 1:1 in eine finale Arbeitsdatei Konzentration von 10 nM Fab erhalten: Quanten-Punkte-Komplex. Verwendung einer äquimolaren Verhältnis begünstigt die Bildung von Mono-funktionalisierten Komplexen eines Quantenpunkt-und einem biotinylierten Fab-Fragment besteht. Dies begünstigt monovalenten Kennzeichnung, die Begrenzung Artefakt Beobachtungen durch Rezeptor-Vernetzung 33,34.
- Inkubieren für 15 Minuten bei 25 ° C unter Verwendung eines Schüttler bei 1.200 Umdrehungen pro Minute eine Aggregation zu verhindern. Die Mischung ist dann bereit, auf lebende Zellen zu verwenden.
- Inkubieren Zellen in 100 ul-Mix für 5 Minuten bei 37 ° C mit 7% CO 2.
- Waschen der Zellen mit nicht-Autofluoreszenzlichtbild Bilderzeugungsmedium (HBSS-Puffer, 1% HEPES, siehe Tabelle der Reagenzien) bei 37 vorgewärmt ° C
- Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige von Etiketten zu verhindern UN-notwendig verderben das SNR um ungebundene, unscharf Quanten-Punkte, indem sie ausführlich Waschen jeder Vertiefung mit Bilderzeugungsmedium, typischerweise 5 mal bei Raumtemperatur mit mindestens 5 Minuten Verzögerung vor dem letzten Waschen.
3. Optischer Aufbau
Die Video-Mikroskopie-Setup besteht aus vier Hauptteilen:
- Mithilfe eines inversen Mikroskops mit einem spezifischen Fluoreszenz-Würfel (FF01-457/50 Anregung, FF495-DI02 dichroitische und FF01-617/73 Emissionsfilter, Semrock) und einer hohen numerischen Apertur (1,3 oder 1,49) Öl-Immersions-100x Objektiv.
- Ein 100-W-Quecksilberlampe (die mit dem Mikroskop durch eine optische Faser, die Vermeidung stören Thermoregulation).
- Ein 512 x 512 Pixel hohe Empfindlichkeit EMCCD-Kamera, einen ausreichenden SNR zu erreichen.
- Ein Inkubator für biologische Proben bei 37 ° C zu halten während des Experiments.
4. Erwerb
- Wählen Sie isolierten und gut Ausbreitung Zellen. Diesbegünstigt die Verlängerung der schönen, flachen Lamellipodien, am besten geeignet, für planare Bewegung der Membran Moleküle aussehen.
- Bewerten Sie die zellulären physiologischen Status durch sein Aussehen sowohl im Durchlicht und Fluoreszenz-in: intensiv vesikulären Verkehr, das Fehlen von nekrotischen oder apoptotischen Zeichen, geringe Autofluoreszenz und mittlere-starke Quantenpunkt-Kennzeichnung (in der Regel bis zu 1.000 Quanten-Punkten pro Zelle, siehe Abb.. 1B, C).
- Wählen Sie einen hohen Dichte Kennzeichnung, die entscheidend zur simultanen Überwachung so viele Rezeptoren wie möglich ist. Dies ist tatsächlich sowohl durch physiologische (Oberflächenexpression, Epitop Zugänglichkeit, seitliche Bewegung) und algorithmischen Parameter (nicht-überlappenden Point-Spread-Funktionen (PSF), auch unter Berücksichtigung der Unschärfen durch Bewegung, um die ordnungsgemäße Erfassung und Wiederverbindung zu erlauben). Begrenzt
- Für jede Zelle wird zunächst einen Hellfeld-Feld-Bild (vorzugsweise unter Verwendung von DIC, wenn verfügbar), die weitere Überprüfung zulassen kann für die Zelle Aspektund räumlichen Grenzen des Lamellipodien.
- Speichern Sie das Bild mit dem gleichen Namen wie die Video-Stapel (wie cell1.tif & cell1.stk zum Beispiel), in einen Unterordner namens DIC, da mit diesen Konventionen, kann der Algorithmus automatisch zurück finden das passende Bild für jeder Stapel.
- Erwerben Sie 1 bis 3 Videos pro Zelle, kontinuierlich, typischerweise bei 36-ms-Rate, die schnellste Geschwindigkeit, die in Full-Frame mit dieser Kamera. Allerdings kann man bei höheren Frequenzen zu erwerben, bis zu 1-ms-Rate, mit dedizierten CCD-Sensor mit erhöhter Empfindlichkeit und / oder weniger Pixel. Die Frame-Transfer-Technologie bietet vernachlässigbare Verzögerung zwischen Frames.
- Electron mehrfach Erweiterung sollte immer bei maximaler (knapp unterhalb der Sättigung, wenn relevant) gesetzt werden, damit erreicht einzelnes Molekül Empfindlichkeit, mit einem ausreichenden SNR, zumindest oberhalb von 20 dB (Peak-Erkennung für eine effiziente 1), in der Regel etwa 25-30 dB.
- In der Regel erwirbt 300 Bilder pro Video, sinCE-Bahnen werden über ~ 100 Frames im Schnitt, meist durch lange blinken Ereignisse beschränkt rekonstruiert. Video Häufigkeit und Länge kann für eine bestimmte Maßnahme, die mehr Spuren zum Beispiel verlangen, angepasst werden konnten.
5. MTT-Analyse
- Wählen Sie den Pfad zu dem Verzeichnis, das die Video-Dateien, um eine bestimmte Datenmenge mit Matlab oder Octave zu bewerten.
- Um die vollautomatische Analyse 1,35 zu starten, geben Sie den Befehl detect_reconnex23 in Octave, oder MTT23i in Matlab. Dieses Programm steht für "Version 2.3, mit User-Interface" und steht zum Download bereit, zusammen mit der Vorgängerversion 2.2. Es zeigt zuerst ein grafisches Interface, in dem alle Parameter verwendet, wie in Abb. 2.
6. Repräsentative Ergebnisse
MTT automatisch analysiert jedes Video-Recorder, um Spuren von erkannt und geschätzt, Ziele, durch weitere ergänzt liefern inchungen, wie Einschluss Detektion. Dies ermöglicht letztendlich Mapping Spuren über Zell-Bilder (Abb. 1C und 3).
MTT-Beschreibung
Der Kern MTT Analyse wird über jeden Rahmen durchgeführt unter Berufung auf drei Hauptaufgaben (Abb. 3):
- Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Ziels (Quantenpunkt-), innerhalb eines gleitenden Teilbereich nacheinander um jedes Pixel zentriert ist, wobei zwei Hypothesen verglichen: Gegenwart entweder eines Signals, mit dem PSF als zweidimensionale Gauß-Peak modellierte , oder nur Lärm, unter Verwendung eines Schwellenwertes versichern niedrig genug Fehlalarm, mit weniger als einem unechten Erkennung pro Frame. Dies führt zu einer Karte Detektionswahrscheinlichkeit. Jede lokale Maximum ergibt, als mögliches Zielgen erlaubt, sichergestellt wird, dass die Wahrscheinlichkeit höher als ein Mindestwert, richtet sich nach der gewünschten Wahrscheinlichkeit eines falschen Alarms (PFA) ist. Diese Grenze ist tief genug, um effizient zu diskriminieren SIGSignale vom Rauschen und vermeidet bestenfalls falsche Erkennungen (PFA von 10 -6 standardmäßig auf weniger als ein Fehler in 512 x 512 Pixel Bilder zu versichern), während immer noch eine ausreichend hohe Wahrscheinlichkeit der Aufdeckung und erreichte damit den theoretisch vorhergesagten optimalen ein. Beachten Sie, dass das Erfordernis der Verwendung eines Teilbereich bedeutet, dass die Bildränder (3 Pixel, für eine Standard-Fenster von 7 x 7 Punkte) nicht ausgewertet werden kann.
- Schätzung für jedes detektierte Ziel, der relevanten Parameter, wie Subpixel-Position und der Signalintensität. Für jedes detektierte Ziel wird eine Methode der kleinsten Quadrate Gauß-Newton-Sitz nächsten durchgeführt, um die Position, Breite und Höhe des detektierten Gauß zu schätzen. Dies stellt insbesondere die Subpixel-Position des Farbstoffs (10 bis 20 nm Genauigkeit für typische SNR-Werte und unbeweglich und langsam diffundierende Farbstoffe, jedoch bis zu ~ 100 nm für Farbstoffe Diffundieren bei 0,1 um 2 / s).
- Reconnection der neuen Ziele mit derSpuren bereits in den vorangegangenen Frames aufgebaut. Die Reihe neuer Ziele mit dem Satz von vorhergehenden Spuren abgestimmt. Zu diesem Zweck, um jedes Ziel eine Spur zuzuordnen, wenn möglich, alle erhältlich statistischer Information zur Detektion Schritt verwendet wird, nicht nur die Position, sondern auch die Intensität, Breite, zu blinken, und die zugehörigen Statistiken. Daher werden Ziele nicht nur auf die nächste Spur zugewiesen: im Falle von kreuzenden Spuren, Intensität, Geschwindigkeit, Breite und blinkende werden berücksichtigt. Dies liefert die statistisch optimale Wiederanschluss des Gastes. Diese Strategie vermeidet, wenn möglich, das Vorspannen des Wiederverbindung zu den nächsten Nachbarn.
Detektierten Peaks können im Nachhinein abgelehnt werden, wenn ihrer Einschätzung oder Wiederverbindung scheitert sein. Eine besondere Prüfung übernimmt die Erkennung von neuen Spitzen, die neue Spuren zu initiieren würde. Dieser Test verwendet eine strengere PFA (10 -7), da Sie wieder eine Spitze, um eine Spur können de facto als Bestätigung interpretiert werden o f seine Relevanz (dieses Kriterium als per Definition nicht anwendbar für neue Peaks).
Trajektorienanalyse
Mögliche vorübergehende Entbindung nächsten durch eine Funktion umgekehrt proportional zur lokalen Verbreitung 24-29 im Zusammenhang ausgewertet. Die Anwendung ermöglicht einen Schwellenwert zu definieren, beschränkt oder nicht Episoden. Durch diese Iteration über alle Spuren, können wir abbilden Membran Dynamik im Hinblick auf die vorübergehende Haft / verlangsamen Veranstaltungen. Dies kann alternativ dargestellt werden entweder mit dem Binär-oder diskrete Werte dieser Beschränkung Index.
Standardmäßig MTT diese Aufgaben automatisch und spart 8 Peakparameter in einer Textdatei: Frame-Nummer, Offset-i und j Position, Signalstärke, den Radius und blinken, für jeden Video-Frame (Gruppe von 7 Zeilen) und Spurenelemente (Spalte) . Diese Ausgabeparameter kann in Matlab oder Octave mit dem fread_data_spt Skript für die weitere Analyse dh Spuren oder Signalintensitäten geladen werden, wie in der beispielhaft "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example Skript im Anhang.
Weitere Analysen führen zu Spuren in jeder Zelle zugeordnet werden (Abb. 1C und 3) und Histogramm-Verteilung für die relevanten Parameter (wie zB Peak-Intensitäten, SNR oder lokale Diffusion Werte) zu schaffen. Für jede Datei, Mittelwert und Standardabweichung der einzelnen Parameter werden in einer Textdatei gespeichert, zusammen mit einem Bild der Histogramme. Logarithmisch-Distributionen, wie zum Quadrat Verschiebungen R 2, auf geometrische Mittel führen. Der Diffusionskoeffizient D wird aus einer linearen Anpassung in den fünf ersten Punkte der MSD-Kurve berechnet. Diese Werte geben einen Überblick über ein Experiment mit zum Beispiel Kinetik der zellulären Reaktionen oder pharmazeutische / enzymatische Behandlungen beeinflussen Membran Organisation. Da MTT ist ein Open-Source-Code, kann dieser Aspekt ohne weiteres auf jeden engagierten Untersuchung angepasst werden.
599fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Abbildung 1. Überwachung Membranrezeptoren Dynamik MTT. (A) Membrankomponenten, wie EGFR, sind markiert mit Quanten-Punkten gekoppelt ist, um biotinylierte Fab-Fragmente (schematische Zeichnung mit annähernd richtig Skalierung jedem Molekül). (B) Typische fluoreszierende Bild von einer Live-COS-7 Zelle erworben, mit 36-ms Belichtungszeit, Darstellung beugungsbegrenzten Peaks, die individuell beschriftet Rezeptor. (C) Ausgang des MTT-Analyse zeigt die rekonstituierte Bahnen der Rezeptoren auf der Hellfeldbild der Zelle überlagert.
Abbildung 2. MTT Eingabeparameter. Laufen MTT23i öffnet eine grafische Benutzeroberfläche listet alle Input-Parameter, Namen und Standardwerte, wie in unseren früheren Publikation 1 beschrieben. In den Algorithmus, Raum und Zeit Parameter (Suchfenster, Spitzenradius, maximale Verbreitung und blinkend) sind in dimensionslosen Standard-Einheiten, Pixel und Rahmen. Kalibrierungen können im Nachhinein zu Ausgabeergebnisse umwandeln angewendet werden. Default-Werte, entsprechend einer Cascade 512BFT mit 100-facher Vergrößerung, sind Pixel-Größe: 156 nm / pxl und Frame-Verzögerung: 36 ms / Frame.
Die Ermittler sollten die Optimierung ein paar kritische Parameter, wie zB der maximal zu erwartenden Diffusionskoeffizienten ("Diff max") und einem maximalen blinkt Verschwinden ("T off"). Diese beiden Raum und Zeit Limits sind fast die einzigen, die zu überdenken für einen bestimmten experimentellen Bedingungen, die anderen nach robusten Standardwerte werden gesetzt werden müssen. Zum Beispiel wird die Anzahl von Fehlalarmen direkt auf weniger als einem Fehler pro Millionen Pixel, so dass weniger als einmal pro Frame, was zufriedenstellend in den meisten Fällen zu gewährleisten. Alle Parameter werden in einer Textdatei in der Ausgabe-Ordner gespeichert, so dass Anwender im Nachhinein zu überprüfen, welche Einstellungen wurden für die Analyse verwendet.
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Bild 3 "/>
Abbildung 3. Wichtige Schritte des MTT-Analyse. Ausgehend von einem Stapel von experimentellen Fluoreszenzbilder werden Peaks nacheinander und automatisch erkannt, geschätzt durch eine Gauß-Sitz und wieder über Rahmen (erste Reihe von Operationen, oberen Teil des Flussdiagramms). Die Spuren können weiter nach möglichen Einschluss untersucht werden, zum Beispiel, was letztlich zu einer dynamischen Karte von relevanten Deskriptoren (zweite Reihe von Operationen, unterer Teil).
Abbildung 4. Labeling Wertigkeit hat keinen Einfluss auf MTT. Um die mögliche Voreingenommenheit durch artifizielle multivalenten Kennzeichnung eingeführt zu bewerten, wurde MTT-Analyse durchgeführt, um endogenen EGFR getaggt mit 2 verschiedenen Systemen, zur Generierung und Analyse von Trajektorien Karten zu verfolgen. (A)-Rezeptoren wurden mit biotinylierten Fab und Quanten-dots605-Streptavidin markiert, wie im Protokoll beschrieben.In diesem Fall kann die Multi-Quanten-Wertigkeit von Punkten und Streptavidine in Kopplung mehrerer Rezeptoren an einen einzigen Farbstoff führen. (B)-Rezeptoren wurden mit Fab direkt mit einem organischen Farbstoff, ATTO647N gekoppelt ist markiert. In diesem Fall kann man Fab, damit ein Rezeptor, um mehr als einen Farbstoff gekoppelt sein. (C) mittleren quadratischen Verlagerung (MSD)-Kurve für alle Spuren für jede Zelle berechnet wurde, entweder mit Quantenpunkt-Farbstoffe oder Atto (links und rechts Graphs, jeweils) markiert. Diffusionskoeffizienten wurden durch lineare Anpassung in den fünf ersten Punkte der MSD (rote gepunktete Linie) berechnet. Jedes Schema der Kennzeichnung führten zu ähnlichen Werten Diffusion (Zentral Grafik). Qdot: Quanten-dots605 (n = 5 Zellen), Atto: ATTO647N (n = 7 Zellen), ns: nicht signifikant (Student t-Test p-Wert> 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In Einzelpartikel-Tracking, neben den Zellen und Mikroskopie Aspekte stellt die Analyse einen wesentlichen Teil der Arbeit. Diese befasst sich mit der Algorithmus verwendet, um die drei wichtigsten Aufgaben: Erkennen, Abschätzen und wieder Gipfeln über jeden Frame. Aber die konsequente Aspekt dieser Arbeit besteht in der Erarbeitung des Algorithmus selbst, die müssen für jede neue dedizierte Untersuchung, im Wesentlichen für den letzten, zusätzliche Schritte (wie Entschlüsselung Arten der Bewegung, Interaktionen oder Stöchiometrie) angepasst werden kann.
Sobald jedoch der Algorithmus ist voll entwickelt, läuft es einfach, zumal wir Aufmerksamkeit auf die Beibehaltung der Anzahl der Input-Parameter auf Minimum (Abb. 3). Dies macht MTT sehr robust und einfach zu implementieren. Bei der Ausarbeitung MTT, ging es uns völlig überdenken die analytischen Möglichkeiten für jede Aufgabe eingesetzt. Wir wollten den Prozess entlang zweier Achsen herausfordernden optimieren:
- Der Umgang Witzh hohe Dichten von Etikettierung bietet detaillierte räumliche Information in der Bezeichnung der Zelloberfläche Probenahme. Im Idealfall würde man versuchen, eine nahezu vollständige molekularen Population gleichzeitig zu folgen, um eine umfassende Beobachtung zu erhalten. Allerdings wäre eine solche erschöpfende Kennzeichnung zu einem Bild ähnlich dem klassisch durch Immunfluoreszenz erhalten zu führen, ohne Einzel-Molekül-Auflösung, da alle Etiketten stark durch Beugung überlappen. Für typische Molekülzahl (dh ~ 10 5-Rezeptoren durch die Zelle 30) und Zellgröße (dh ~ 30 um), wenn man eine homogene Verteilung annehmen, ist die durchschnittliche Inter-Molekül Abstand ~ 100 nm aufweist. Diffusion während der Akquisition trägt auch zur Verbreitung der PSF in einem vergleichbaren Umfang: typischerweise ~ 100 nm für die Brownsche Bewegung bei 0,1 mu m 2 / s bei 30 ms. Bemerkenswert ist diese Ausbreitung isotroper im Durchschnitt und damit immer noch erzeugt ein Gauß-ähnliche PSF. Daher bis zu 10% der Bevölkerung theoretisch nachgewiesen werden, da dies lead zu einem mittleren Abstand von ~ 300 nm, kompatibel mit Beugung und Bewegung Grenzen. Allerdings muss diese zu modulieren durch Buchungsbelege für Inhomogenität in der räumlichen Verteilung, Etikettieren Einschränkungen (wie z. B. sterische Einschränkungen, Epitop Zugänglichkeit usw.), die Erhöhung und sogar unlösbare Konflikte durch Kreuzung Trajektorien, und insgesamt Entdeckung. Experimentell konnten wir erreichen und genau zu überwachen einen wesentlichen Anteil an der Gesamtbevölkerung, mit Dichten von ~ 1000 Etiketten in einem Sichtfeld von 80 um Breite. Diese obere Grenze ergibt sich aus einem Kompromiss zwischen dem Bedürfnis nach individueller Erkennungen und dem Ziel einer vollständigen räumlichen Messung (siehe Abb. 1C, um die räumliche Abtastung von der Zelloberfläche zu schätzen wissen).
- Umgang mit dem schwächsten möglichen SNR ermöglicht die Abbildung entweder bei geringer Beleuchtung, was sich positiv für Zellen Lebensfähigkeit und / oder bei hohen Geschwindigkeiten, die eine bessere zeitliche Informationen zur Verfügung stellt. Allerdings bedeutet dies niedrigere Signalepro Bild, aufgrund der geringeren Anzahl der gesammelten Photonen. Beachten Sie, dass die kürzeste erreichbare Timing von EMCCD Kameras (1 ms), um auf den niedrigsten akzeptablen SNR (20 dB) für die richtige Erkennung und Einschätzung von MTT entsprechen scheint.
Beschriften Wertigkeit ist ein immer wiederkehrendes Thema in einzelnen Moleküls Studien. In der Tat wird direktes Maß für die Farbstoff / Zielverhältnis sehr anspruchsvollen 34. Allerdings besteht eine alternative Möglichkeit zur Untersuchung der mutmaßlichen Bias durch artifizielle multivalenten Kennzeichnung eingeführt im Vergleich Maßnahmen entweder mit Quantenpunkt-Tags (mit mutmaßlich mehrere Ziele pro Farbstoff, induzieren artifizielle Vernetzung) oder organischen Farbstoff-Tags (mit, bei Gegenteil, mutmaßlich mehrere Farbstoffe pro Ziel, Vorspannung nur Signalintensität und Bleichen Eigenschaften). Wir und andere haben 6,36,37 vergleichbares Verhalten beobachtet werden, wenn entweder mit Quantum-Dots oder organische Farbstoffe (ATTO647N in unserem Fall, Abb. 4), in Bezug auf die Verbreitung und Übergang zwischen modes der Bewegung. Variation der Diffusion Werte zwischen den zwei Bedingungen niedriger ist als die Zelle-zu-Zell-Unterschiede (4C). Dies zeigt, dass die Kennzeichnung Wertigkeit, wenn auch nicht streng einwertigen, keinen signifikanten Einfluss SPT Ergebnisse.
Confinement und molekularen Interaktionen
Transienten oder stabilen Einschluss kann als die Signatur der bevorzugte Affinität oder Interaktion 24-29 interpretiert werden. Biomembranen sind in der Tat stark inhomogenen, mit lokalen Versammlungen durch strukturelle Merkmale, wie Hydrophobizität, Transmembran Größe und Grenzflächenspannung diktiert. Diese treibenden Kräfte, um räumlich-zeitliche Umgestaltung der funktionalen Baugruppen mit eine entscheidende Rolle für die Signalisierung, dh, Haftung oder Menschenhandel führen. Kartierung und Quantifizierung solcher Ereignisse wird erwartet, dass ein Schlüssel zu entschlüsseln, wie eine Zelle ständig präsentierten Stimuli integriert sind. In der Tat für eine Zelle, zeigt eine entsprechende Anpassung durch eine genaue Antwort requires Tuning Interaktionen zwischen den Partnern signalisieren und ihre Umwelt. Membran-Rezeptoren interagieren kann entweder mit dem Sub-Membran Zytoskelett Zäune, Membranstrukturen wie endozytischen Gruben oder fokalen Adhäsionen, oder auch Eiweißpulver / Lipid-Partnern, in der Signaltechnik-Domains zum Beispiel beteiligt. In unserer Darstellung, können solche Ereignisse durch Einschluss Stärke und seine Variationen über Raum und Zeit untersucht werden. Dies stärkt die Bedeutung der Zusammenarbeit auf dem höchsten erreichbaren Raum-Zeit-Auflösung, unter Berücksichtigung der Einschränkungen verbunden, um kurze Timings und hohen Dichten, wie oben diskutiert.
Komplementäre Techniken
Es ist eine gute Übung, solche dynamische Messungen mit anderen Ansätzen zu vergleichen. Zum Beispiel andere dynamische Mikroskopie-Techniken, wie FRAP und FCS, bieten ergänzende Empfindlichkeit und Auflösung 4,38,39. FRAP bietet ein Ensemble Messung der molekularen Diffusion, während FCS s erreichen könnenIngle-Molekül-Empfindlichkeit, mit einer sehr guten Zeitauflösung. Allerdings sind beide Methoden von Natur aus zu einer lokalen Maßnahme (in der Regel innerhalb von einem konfokalen Punkt) beschränkt. Dies motivierte uns zu nutzen und die Grenzen der räumlichen Möglichkeiten der SPT: Untersuchung einer großen Sichtfeld, um eine ganze Zelle auf einmal umfassen, zusammen mit einem lokal relevanten raumzeitlichen Genauigkeit.
Weitere Entwicklungen & Investigations
Nach der Reihe von biologischen Fragen, die angesprochen mit Einzel-Molekül-Messungen werden kann, kann MTT entlang verschiedener Richtungen erweitert werden, auf jeder Ebene: Erkennung, Einschätzung, Wiederverbindung und weitere Analysen. Zum Beispiel kann ein betrachten den Umgang mit mehr als einem molekularen Bevölkerung und forderte Multicolor-Erkennung - wie kann mithilfe gewidmet Optik oder analytischen Systemen werden. Schätzung können neue relevante Deskriptoren, ebenso wie alle spektralen Informationen oder Polarisation oder die axialez-Position, für die Verlängerung Tracing in 3D-40.
Für Wiederverbindung können die Brownsche und blinkt Annahmen voll für ein bestimmtes Problem zu überdenken. Interessant genug, Einzel-Molekül-Messungen wurden in den letzten zehn Jahren zu den sogenannten nanoskopischen Regime 17,22,23 verlängert. Obwohl MTT direkt Adressierung Einzel-Molekül-Lokalisation, ist es von entscheidender Bedeutung, um den Fall einer festen Probe, die eine sichere Lösung für eine umfassende Lokalisierung eines molekularen Bevölkerung bietet betrachten. In einem solchen Fall ist die Brownsche Annahme nicht mehr gültig. Ersetzen sie durch präzise Umgang mit einer nanoskopischen Maßnahme, die nur durch SNR beschränkt ist, ist entscheidend für das Erreichen der besten Auflösung im Nanometerbereich.
Neben solchen Entwicklungen, die auf beiden multicolor, 3D-und / oder erschöpfende Maßnahmen basiert, wird die zukünftige Arbeit erwartet, dass sie einen umfassenden Einblick in molekulare statische und dynamische Daten zu liefern. Dies wird sich unmittelbar relevANCE für zellbiologische Studien, wie die Entschlüsselung der subtilen Modalitäten regeln extra und intrazellulären Signalübertragung.
Herunterladen von MTT
Der Quellcode von MTT ist als Open-Source-Software für die akademische Forschung. Es ist aus unserer Web-Seite heruntergeladen werden kann, bei ciml.univ-mrs.fr , indem Sie zu unserem Team auf der Seite, Er & Marguet Lab, das bietet einen Link für die Software-Beschreibung und Download. Bitte beachten Sie, dass wir Sie bitten Ihren Namen und Ihre Institution nur zur Information, zum Beispiel im Falle der weiteren Zusammenarbeit oder um Sie über eine neue Version oder ein Update zu informieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Mitgliedern unseres Teams, vor allem MC Blache für technische Unterstützung, sowie M-und B-Irla Imhof, für ihre Unterstützung und fruchtbare Diskussionen. Zahlen für Deflation und Entbindung reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Nature Methods. Dieses Projekt wird von institutionellen Zuschüssen aus dem CNRS, INSERM und Marseille-Universität, und durch gezielte Zuschüsse aus der Region Provence-Alpes-Côte d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR unterstützt-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) und der Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR wird durch ein Stipendium der Ligue Nationale Contre le Cancer unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M.
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M.
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J.
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C.
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
