Summary
Objetivos múltiples de seguimiento es un algoritmo desarrollado para el seguimiento de fabricación casera individualmente moléculas marcadas dentro de la membrana plasmática de las células vivas. De manera eficiente la detección, la estimación y el seguimiento de las moléculas a través del tiempo en la alta densidad proporcionan un fácil de usar, herramienta completa para investigar la dinámica de la membrana a nanoescala.
Abstract
Nuestro objetivo es obtener una descripción completa de los procesos moleculares que ocurren en las membranas celulares de diferentes funciones biológicas. Nuestro objetivo es la caracterización de la organización compleja y dinámica de la membrana plasmática en una sola molécula de nivel, mediante el desarrollo de herramientas analíticas dedicadas a una sola partícula de seguimiento (SPT) en alta densidad: Múltiples-Objetivo de Búsquedas (MTT) 1. Una sola molécula de videomicroscopía, ofreciendo milisegundos y resolución nanométrica 1-11, permite una representación detallada de la organización de la membrana 12-14 con precisión la cartografía descriptores tales como la localización de los receptores de la célula, la movilidad, el parto o interacciones.
Volvimos a visitar el SPT, tanto a nivel experimental y algorítmicamente. Aspectos experimentales incluyeron la optimización de la configuración y el etiquetado de células, con un énfasis particular en alcanzar la densidad de etiquetado más alto posible, a fin de proporcionar una instantánea dinámica de una dinámica moleculars que se produce dentro de la membrana. Problemas algorítmicos en cuestión cada paso utilizado para la reconstrucción de las trayectorias: la detección de picos, la estimación y la reconexión, se dirigió a las herramientas específicas de análisis de imagen 15,16. Implementación de la deflación después de la detección permite que los picos rescate oculto inicialmente por los picos vecinos, más fuertes. Es de destacar que la mejora de la detección de un impacto directo en la reconexión, por la reducción de las diferencias dentro de las trayectorias. Las presentaciones han sido evaluadas utilizando simulaciones de Monte Carlo para la densidad de etiquetado diferentes y los valores de ruido, que normalmente representan las dos principales limitaciones de las mediciones paralelas con una resolución espacial y temporal de alta.
La precisión nanométrica 17 obtenido por moléculas individuales, usando ya sea sucesiva de encendido / apagado óptica photoswitching o no lineal, puede entregar observaciones exhaustivas. Esta es la base de los métodos de Nanoscopia 17 como TORMENTA 18, PALM 19,20, 21 o RESOLFT STED 22,23, WHICH menudo pueden requerir muestras de imágenes fijas. La tarea principal es la detección y estimación de los escasos picos de difracción que emanan de una sola molécula. Por lo tanto, proporcionar las hipótesis adecuadas, tales como el manejo de una precisión de posicionamiento constante en lugar del movimiento browniano, el MTT es francamente adecuado para el análisis de nanoscópicos. Además, MTT fundamentalmente se puede utilizar en cualquier escala: no sólo para las moléculas, sino también para las células o animales, por ejemplo. Por lo tanto, MTT es un algoritmo de seguimiento de gran alcance que tiene aplicaciones a escala molecular y celular.
Protocol
En este video, se presenta un solo experimento completo rastreo de partículas, utilizando los puntos cuánticos dirigidos a un receptor de membrana específico. El objetivo principal de este experimento consiste en la discriminación de los diferentes tipos de comportamientos de la difusión molecular de medición dentro de la membrana plasmática de las células vivas. En efecto, los movimientos moleculares que surgen en la membrana típicamente puede desviarse de difusión browniano al ser linealmente dirigido o confinado dentro nanodomains 26-29, por ejemplo. Nuestro objetivo es al mismo tiempo después de que muchos receptores como sea técnicamente posible, para proporcionar una instantánea de la variedad que surge en la dinámica que ocurren dentro de la membrana de una célula viva. Esto es en última instancia, espera que permita descifrar los mecanismos que regulan la señalización celular de los receptores de la superficie.
1. Cultivo Celular
- Preparar la muestra de células: el uso adherentes células COS-7, que expresan el receptor de forma endógena del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) 30. Cuandotrabajar con células vivas, sin antibióticos, asegúrese de no tener latencia sub-detectable la contaminación mediante el uso de técnicas adecuadas de estériles en todo momento durante la preparación.
- Se cultivan las células en medio completo (DMEM con suero de ternera al 10%, 1% de glutamina, HEPES 1% y 1% de piruvato sódico, véase la tabla de reactivos específicos a continuación), a 37 ° C con 7% de CO 2, teniendo cuidado de tener en ellos sub-confluentes, el crecimiento exponencial antes de extenderse en Lab-Tek.
- El día antes del experimento, se extendió 5.000 células / pocillo en 8 y cámaras (Lab-Tek) y se incuba durante la noche. Contando células asegura una densidad celular constante, por lo tanto una relación reproducible de cuántica puntos por celda.
2. Etiquetado de la célula
Preparar cuánticos-puntos con un recubrimiento específico. Quantum-puntos son nanopartículas fluorescentes compuestos de semiconductores. Estas nanopartículas presentan un gran interés debido a que son muy brillantes y fotoestable en comparación con el clásicosondas fluorescentes 31,32, lo que permite el logro de una señal apropiada a ruido (SNR) para obtener imágenes de una sola molécula.
- Antes del experimento, producir fragmentos Fab contra EGFR de la línea celular de hibridoma (AcMo 108, ATCC HB 9764), mediante digestión con papaína como se ha descrito previamente 21.
- Conjugado con biotina Fab, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (EZ-Link sulfo-NHS-LC-kit de biotinilación, Thermo Scientific, Fig. 1A)..
- Utilizar cuántica puntos funcionalizados con estreptavidina (Invitrogen) y emisor a 605 nm (longitud de onda de emisión óptima para la brillantez, la detección y separación de autofluorescencia celular).
- Preparar la solución de etiquetado en medio completo (véase la tabla de los reactivos específicos), con el fin de saturar las streptavidins presentes alrededor de los puntos cuánticos, así como para prevenir la agregación y la unión no específica a las células y al cubreobjetos.
- Preparar dos soluciones intermedias:uno con los puntos cuánticos-estreptavidina y otro con biotina Fab, cada uno a 20 Nm.
- Mezclar un volumen igual de estas dos soluciones: mezclar los puntos cuánticos con Fab en proporción de 1:1 para obtener una concentración final de trabajo de 10 nM Fab: cuánticos-puntos complejo. Usando una relación equimolar favorece la formación de mono-funcionalizados complejos compuestos por un puntos cuánticos y un fragmento Fab biotinilado. Esto favorece el etiquetado monovalente, limitando observaciones artefactos debidos a los receptores de reticulación 33,34.
- Incubar durante 15 minutos a 25 ° C, utilizando un agitador a 1.200 revoluciones por minuto para evitar la agregación. La mezcla es entonces listo para su uso en células vivas.
- Se incuban las células en 100 l de mezcla durante 5 minutos a 37 ° C con 7% de CO 2.
- Lavar las células con medio de imágenes no autofluorescente (tampón HBSS, HEPES 1%, ver tabla de reactivos específicos) previamente calentada a 37 ° C.
- Retire con cuidado el exceso de etiquetas para evitar que las Naciones Unidasnecesario estropear la SNR por no unido, fuera de foco cuánticos-puntos, por lavado extensivamente cada pocillo con medio formador de imágenes, típicamente 5 veces a temperatura ambiente, con al menos 5 minutos antes de retraso del último lavado.
3. Configuración óptica
La configuración de video-microscopía se compone de cuatro partes principales:
- Un microscopio invertido con un cubo específico de fluorescencia (FF01-457/50 excitación, dicroico FF495-DI02, y FF01-617/73 filtros de emisión, Semrock) y una gran apertura numérica (1,3 o 1,49) de inmersión en aceite objetivo 100x.
- Una lámpara de mercurio de 100 W (acoplado al microscopio a través de una fibra óptica, evitando interferir con la termorregulación).
- Una sensibilidad de 512 x 512 píxeles de alto EMCCD la cámara para obtener una buena relación señal ruido.
- Una incubadora para mantener las muestras biológicas a 37 ° C durante el experimento.
4. Adquisición
- Seleccione las celdas aisladas y bien extendido. Estefavorece la extensión de lamellipodia bonito, plano, que mejor se adapte a buscar movimiento plano de las moléculas de la membrana.
- Evaluar el estado fisiológico celular por su apariencia, tanto en la luz transmitida y fluorescencia: el tráfico vesicular intensa, ausencia de signos de necrosis o apoptosis, la autofluorescencia de baja y media-fuerte de puntos cuánticos de etiquetado (por lo general hasta 1.000 cuántica puntos por celular, ver fig. 1B, C).
- Seleccione una densidad de etiquetado de alto, que es fundamental para el seguimiento al mismo tiempo receptores de la mayor cantidad posible. Esto es realmente limitado tanto por fisiológica (expresión en la superficie, la accesibilidad epítopo, el movimiento lateral) y los parámetros de algoritmos (no superposición de funciones de cálculo de punto (PSF), incluso teniendo en cuenta borrosa debido al movimiento, para permitir la detección adecuada y reconexión).
- Para cada celda, primero adquirir una imagen de campo campo claro (preferentemente utilizando DIC, si está disponible) que además puede permitir la comprobación de la célula aspectoy los límites espaciales de la lamellipodia.
- Guarda esta imagen con el mismo nombre que el video-pila (como cell1.tif y cell1.stk por ejemplo), en una subcarpeta denominada CID, ya que, con estos convenios, el algoritmo de forma automática se puede encontrar de nuevo la imagen correspondiente para cada pila.
- Adquirir 1 a 3 videos por celular, de forma continua, por lo general a los 36 ms de tasa, la tasa más alta alcanzable en el fotograma completo con esta cámara. Sin embargo se puede adquirir a frecuencias más altas, de hasta 1-ms tasa, utilizando CCD dedicado con aumento de la sensibilidad y / o menos pixeles. La tecnología proporciona el marco de transferencia de retraso insignificante entre los marcos.
- La mejora de electrones se multiplican siempre debe estar al máximo (justo debajo de la saturación, en su caso) para permitir alcanzar la sensibilidad sola molécula, con un número suficiente de SNR, por lo menos por encima de 20 dB (para la detección eficaz de pico 1), por lo general alrededor de 25-30 dB.
- Por lo general adquieren 300 imágenes por vídeo, el pecadoce se reconstruyen las trayectorias de más de ~ 100 marcos, en promedio, en su mayoría limitados por largos eventos parpadeo. La frecuencia y la duración del vídeo se puede adaptar para una acción determinada, lo cual podría requerir más rastros, por ejemplo.
5. MTT Análisis
- Seleccione la ruta al directorio que contiene los archivos de video para evaluar un determinado conjunto de datos con Matlab u Octave.
- Para iniciar el análisis totalmente automatizado 1,35, escriba el comando detect_reconnex23 en Octave, o MTT23i en Matlab. Este programa representa "la versión 2.3, con interfaz de usuario" y está disponible para su descarga, junto con la versión anterior 2.2. En primer lugar, muestra un interfaz gráfico listado de todos los parámetros utilizados, como se muestra en la fig. 2.
6. Los resultados representativos
MTT analiza automáticamente cada grabadora de vídeo, para entregar las huellas de los objetivos detectados y estimados, complementados por más devestigaciones, como la detección de confinamiento. En última instancia, permite que las huellas de mapeo sobre las imágenes de células (Fig. 1C y 3).
Descripción MTT
El análisis de MTT núcleo se realiza sobre cada fotograma, invocando 3 tareas principales (Fig. 3):
- La detección de la presencia o ausencia de un objetivo (puntos cuánticos), dentro de un deslizamiento subregión sucesivamente centrado alrededor de cada píxel, donde se comparan dos hipótesis: o bien la presencia de una señal, con el PSF modelizado como un pico bidimensional gaussiana , o sólo el ruido, con un umbral bajo de falsas alarmas asegurar suficiente, con menos de una detección de falsos por cuadro. Esto conduce a un mapa de probabilidad de detección. Cada máximo local se considera como un objetivo putativo, asegurando que su nivel de probabilidad es mayor que un valor mínimo, fijado de acuerdo con la probabilidad deseada de falsa alarma (PFA). Este límite se fija lo suficientemente bajo como para discriminar de manera eficiente SIGnales de ruido, evitar en el mejor de detecciones espurias (PFA de 10 -6 por defecto, para asegurar que menos de un error en 512 x 512 imágenes de píxeles), al tiempo que permite una probabilidad suficientemente alta de detección, llegando a la teoría predice un óptimo. Tenga en cuenta que el requisito de utilizar una sub-región implica que los bordes de la imagen (3 píxeles, por un defecto de la ventana de 7 x 7 píxeles) no se puede evaluar.
- Estimación, para cada objetivo detectado, de los parámetros pertinentes, como sub-píxel posición e intensidad de la señal. Por cada objetivo detectado, una de los mínimos cuadrados de Gauss-Newton ajuste se realiza próxima para estimar la posición, anchura y altura de la gaussiana detectado. Esto permite en particular la posición de sub-píxel del medio de contraste (10 a 20 nm para la precisión de los valores típicos de SNR y tintes inmóviles o difundir lentamente, aumentando hasta ~ 100 nm para la difusión de los colorantes a 0,1 m 2 / s).
- Reconexión de los nuevos objetivos con elhuellas ya construido en los fotogramas anteriores. El conjunto de nuevos objetivos se corresponde con el conjunto de restos anteriores. Para este propósito, a fin de asignar a cada objetivo a una huella, si es posible, toda la información disponible estadística obtenida de la etapa de detección se utiliza, no sólo la posición, pero también intensidad, ancho, parpadeando y las estadísticas asociadas. Por lo tanto, los objetivos no sólo están asignados a la más cercana de seguimiento: en el caso de los rastros que cruzan, la intensidad, la velocidad, el ancho y el parpadeo se tendrán en cuenta. Esto ofrece la puntuación de reconexión estadísticamente óptimo. Esta estrategia evita, siempre que sea posible, la reconexión de polarización hacia los vecinos más cercanos.
Picos detectados a posteriori puede ser rechazada si su estimación o reconexión falla. Un examen especial se encarga de la detección de nuevos picos, que iba a iniciar nuevas trazas. Esta prueba utiliza un más estricto de PFA (10 -7), ya que volver a conectar un máximo de un rastro puede ser interpretado de facto como la validación o f su importancia (este criterio es, por definición, no es aplicable para nuevos picos).
Trayectoria Análisis
Confinamiento transitoria Posible está próximo evaluada por una función inversamente relacionada con la difusión local 24-29. La aplicación de un umbral permite definir limita o no episodios. Al iterar sobre ellos todos los rastros, podemos trazar la dinámica de la membrana, en términos de reclusión transitoria / frenar los acontecimientos. Esto puede ser alternativamente representada utilizando el binario o valores discretos de este índice confinamiento.
De forma predeterminada, MTT realiza automáticamente las tareas, el ahorro de 8 parámetros máximos en un archivo de texto: el número de fotograma, i y la posición j, intensidad de la señal, el radio, que se compensan y parpadear, para cada fotograma de vídeo (grupo de 7 filas) y trace (columna) . Estos parámetros pueden ser recargadas en Matlab u Octave usando el script fread_data_spt para un análisis posterior de las huellas es decir, o intensidad de la señal, como se ejemplifica en el "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example secuencia de comandos en el apéndice.
Otros análisis conducen a trazar huellas en cada celda (Fig. 1C y 3) y para proporcionar una distribución del histograma para los parámetros pertinentes, como el pico de intensidad, SNR o valores locales de difusión). Para cada archivo, media y desviación estándar de cada parámetro se guardan en un archivo de texto, junto con una imagen de los histogramas. Distribuciones logarítmicas, como para los desplazamientos cuadrados r 2, conducir a la media geométrica. El coeficiente de difusión D se calcula a partir de un ajuste lineal durante los cinco primeros puntos de la curva de MSD. Estos valores proporcionan una visión general de un experimento relacionado con la cinética de las reacciones celulares ejemplo o tratamientos farmacéuticos / enzimáticos que afectan a la organización de la membrana. Desde MTT es un código de fuente abierta, este aspecto puede ser fácilmente adaptado a cualquier investigación dedicada.
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Figura 1. Seguimiento receptores de membrana dinámica por MTT. (A) los componentes de membrana, tales como el EGFR, se marcan con puntos cuánticos acoplados a los fragmentos Fab biotinilado (dibujo esquemático con escala aproximadamente correcta de cada molécula). (B) imagen fluorescente típica adquirida a partir de un en vivo de células COS-7, con el tiempo de exposición de 36 ms, que representa difracción limitada picos correspondientes a los receptores etiquetadas individualmente. (C) de salida del análisis MTT mostrando las trayectorias reconstituidas de los receptores, superpuesta a la imagen campo claro de la célula.
Figura 2. MTT parámetros de entrada. Ejecución MTT23i abre una interfaz gráfica de usuario lista de todos los parámetros de entrada, los nombres y los valores predeterminados, como se describe en nuestra publicación anterior 1. En los parámetros del algoritmo, espacio y tiempo (ventanas de búsqueda, el radio máximo, la máxima difusión y parpadeando) se encuentran en unidades adimensionales estándar, los píxeles y los marcos. Las calibraciones se pueden aplicar a posteriori, para convertir los resultados de salida. Los valores por defecto, lo que corresponde a una cascada 512BFT con un aumento de 100x, son píxeles Tamaño: 156 nm / pxl y la demora de fotogramas: 36 ms / frame.
Los investigadores deben optimizar algunos parámetros críticos, tales como el coeficiente de difusión máxima esperada ("Diff máximo") y la desaparición intermitente máximo ("T off"). Estos dos límites de espacio y tiempo son casi los únicos que necesitan ser modificadas para una determinada condición experimental, los otros que se establecen en valores predeterminados robustos. Por ejemplo, el número de falsas alarmas se fija directamente a asegurar menos de un error por cada millón de pixeles, por lo tanto, menos del uno por cuadro, que es satisfactoria en la mayoría de los casos. Todos los parámetros se guardan en un archivo de texto en la carpeta de salida, permitiendo que los usuarios puedan comprobar a posteriori los ajustes que se utilizaron para su análisis.
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Figura 3. Los pasos principales del análisis MTT. A partir de una pila experimental de imágenes de fluorescencia, los picos son secuencialmente y detecta automáticamente, estimado por un ajuste gaussiano y vuelto a conectar más de marcos (primera gama de operaciones, parte superior del diagrama de flujo). Trazas adicional puede ser analizado para el confinamiento putativo, por ejemplo, conduciendo finalmente a un mapa dinámico de descriptores pertinentes (segunda gama de operaciones, parte inferior).
Figura 4. Etiquetado de valencia no tiene impacto en MTT. Para evaluar el posible sesgo introducido por medio del etiquetado multivalente artefactual, el análisis MTT se llevó a cabo para realizar un seguimiento de EGFR endógeno etiquetados con 2 esquemas diferentes, para generar y analizar mapas de trayectorias. (A) Los receptores fueron marcados con biotina Fab y cuántica dots605 estreptavidina, tal como se describe en el protocolo.En este caso, la valencia de varios de los puntos cuánticos y streptavidins puede resultar en varios receptores de acoplamiento a un solo colorante. (B) Los receptores fueron marcados con Fab directamente acoplado a un colorante orgánico, Atto647N. En este caso, un Fab, por lo tanto, un receptor, puede ser acoplado a más de un colorante. (C) La media de desplazamiento cuadrado (MSD) la curva se calculó para todos los rastros de cada celda, con la etiqueta, ya sea con puntos cuánticos como los tintes y Atto (gráficos de izquierda y derecha, respectivamente). Los coeficientes de difusión se calcula en forma lineal a lo largo de los cinco primeros puntos de la MSD (línea roja punteada). Cada sistema de etiquetado llevado a los valores de difusión similares (gráfico central). Qdot: cuántica dots605 (n = 5 células), Atto: Atto647N (n = 7 células), ns: no significativo (t de Student test valor p> 0,05).
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Discussion
En una sola partícula de seguimiento, junto a los aspectos celulares y microscopía, el análisis representa una parte sustancial de la obra. Esto se dirige el algoritmo utilizado para realizar las tres tareas principales: la detección, la estimación y volver a conectar picos de más de cada fotograma. Pero el aspecto consecuente de este trabajo reside en la elaboración del propio algoritmo, que puede ser necesario adaptar a cualquier nueva investigación dedicada, fundamentalmente por los últimos pasos, extra (como descifrar los modos de movimiento, las interacciones o estequiometría).
Sin embargo, una vez que el algoritmo está completamente desarrollada, correr es sencillo, especialmente desde que prestó atención a mantener el número de parámetros de entrada al mínimo (fig. 3). Esto hace MTT muy robusto y fácil de implementar. En la elaboración de MTT, destinadas a reconsiderar por completo las opciones de análisis utilizados para cada tarea. Queríamos optimizar el proceso a lo largo de dos ejes difíciles:
- Tratar el ingenioh densidades altas de etiquetado proporciona información espacial detallada en el plazo de toma de muestras de la superficie celular. Idealmente, uno intenta seguir una población molecular casi completa de forma simultánea, con el fin de obtener una observación integral. Sin embargo, el etiquetado exhaustiva tales daría lugar a una imagen similar a la clásica obtenida por inmunofluorescencia, sin resolución de una sola molécula, ya que todas las etiquetas se superponen fuertemente debido a la difracción. Para el número molecular típico (es decir, ~ 10 5 receptores de la célula 30) y el tamaño de la celda (es decir, ~ 30 m), si se supone una distribución homogénea, el promedio entre molécula de la distancia es de ~ 100 nm. La difusión durante la adquisición también contribuye a la difusión de la FSP en una medida comparable: típicamente ~ 100 nm para el movimiento browniano de 0,1 m 2 / s durante 30 ms. Digno de mención, esta difusión es isotrópica en promedio y por lo tanto sigue generando una PSF gaussiana tipo. Por lo tanto hasta el 10% de la población podría ser teóricamente detectada, ya que esto lead para una distancia promedio de ~ 300 nm, compatible con los límites de difracción y el movimiento. Sin embargo, esto tiene que ser modulada por cuenta de la falta de homogeneidad en la distribución espacial, el etiquetado de las limitaciones (como los impedimentos estéricos, la accesibilidad epítopo, etc), aumentando e incluso los conflictos sin solución debido a las trayectorias que cruzan, y la eficiencia de detección general. Experimentalmente, se podría alcanzar y controlar con precisión una parte sustancial de la población en general, con densidades de ~ 1000 etiquetas dentro de un campo de visión de la anchura de m 80. Esto da como resultado límite superior de un compromiso entre la necesidad de detecciones individuales y el objetivo de una medición exhaustiva espacial (ver fig. 1C para apreciar el muestreo espacial de la superficie celular).
- Manejo de la más débil posible SNR permite obtener imágenes, ya sea en baja iluminación, lo cual es beneficioso para la viabilidad de las células, y / o en alta velocidad, que proporciona una mejor información temporal. Sin embargo, esto implica señales de menorpor imagen, debido a un menor número de fotones recogidos. Nótese que el menor tiempo alcanzable por las cámaras EMCCD (1 ms) parece corresponder a la más baja SNR aceptable (20 dB) para la detección apropiada y la estimación por MTT.
Etiquetado de valencia es un tema recurrente en los estudios de una sola molécula. En efecto, medida directa de la relación de colorante / objetivo es muy difícil 34. Sin embargo, una forma alternativa para investigar el supuesto sesgo introducido por medio del etiquetado multivalente artefactual consiste en comparar las medidas, ya sea con las etiquetas de puntos cuánticos (con objetivos supuestamente varias veces por medio de contraste, la inducción de reticulación artefactual) u orgánicos (con etiquetas de tinte, en cambio, los tintes supuestamente varios por objetivo, intensidad de la señal de polarización única y blanqueo de características). Nosotros y otros 6,36,37 han observado un comportamiento similar cuando se utiliza cualquiera de los puntos cuánticos o colorantes orgánicos atto647N en nuestro caso, la figura. 4), en términos de difusión y la transición entre mesesdes de movimiento. La variación en los valores de difusión entre las dos condiciones es menor que la disparidad célula a célula (Fig. 4C). Esto demuestra que la valencia de etiquetado, aunque no estrictamente monovalente, no afecta significativamente a los resultados del SPT.
Confinamiento y las interacciones moleculares
Confinamiento transitoria o estable puede interpretarse como la firma de afinidad preferencial o interacción 24-29. Biomembranas son, en efecto fuertemente no homogénea, con conjuntos locales dictadas por las características estructurales tales como hidrofobicidad, el tamaño de transmembrana y tensión interfacial. Estos motores llevan a la remodelación de espacio-temporal de los conjuntos funcionales con funciones críticas para la señalización, es decir, la adhesión o el tráfico. Mapeo y cuantificación de estos eventos se espera que proporcione una clave para descifrar cómo una célula integra los estímulos presentados de forma continua. De hecho, para una celda, mostrando una adaptación adecuada a través de una respuesta precisa requires afinar las interacciones entre los socios de señalización y su entorno. Receptores de la membrana puede interactuar, ya sea con vallas del citoesqueleto sub-membrana, las estructuras de membrana, tales como pozos endocítica o adhesiones focales, o también a los socios proteicas / lípidos, que participan en la señalización de los dominios, por ejemplo. En nuestra representación, tales eventos pueden ser investigados por la fuerza el parto y sus variaciones en el espacio y el tiempo. Esto refuerza aún más la importancia de trabajar al más alto nivel alcanzable espacio-tiempo de resolución, teniendo en cuenta las restricciones asociadas a los tiempos cortos y altas densidades, como se mencionó anteriormente.
Técnicas Complementarias
Es una buena práctica comparar tales medidas dinámicas con otros enfoques. Por ejemplo otras técnicas de microscopía dinámicos, como el FRAP y FCS, proporcionan una sensibilidad y resolución complementaria 4,38,39. FRAP proporciona una medición conjunto de la difusión molecular, mientras que FCS puede llegar a single-molécula de la sensibilidad, con una resolución temporal muy buena. Sin embargo, ambos métodos son inherentemente limitado a una medida local (típicamente dentro de un lugar confocal). Esto nos ha motivado para aprovechar y empujar los límites de las posibilidades espaciales de la SPT. Que investigan un amplio campo de visión, para incluir una célula completa a la vez, junto con una precisión espacial y temporal relevante a nivel local
Desarrollos e Investigaciones
De acuerdo con la gama de cuestiones biológicas que se pueden abordar con una sola molécula de mediciones, MTT se puede extender a lo largo de varias direcciones, en cada nivel: detección, valoración, reconexión y otros análisis. Por ejemplo, uno puede considerar tratar con más de una población molecular, llamando para la detección multicolor - como se puede realizar utilizando dedicados esquemas óptica o analítica. La estimación puede incluir nuevos descriptores pertinentes, tales como cualquier información espectral o la polarización, o axiales de laposición z, para extender el rastreo en 3D 40.
Para la reconexión, los supuestos browniano y el parpadeo pueden ser completamente examinada de nuevo para un problema específico. Curiosamente, de una sola molécula de las mediciones se han extendido durante la última década del régimen nanoscópico llamada 17,22,23. A pesar de MTT está directamente frente a una sola molécula de la localización, es de vital importancia tener en cuenta el caso de una muestra fija, que proporciona una solución segura para una localización exhaustiva de una población molecular. Sin embargo, en tal caso, la suposición browniano ya no es válida. Su sustitución por una medida con precisión el manejo de nanoscópico, sólo limitada por SNR, es fundamental para llegar a la mejor resolución nanométrica.
A lo largo de estos avances, o bien de varios colores, 3D y / o las medidas posibles, el trabajo futuro se espera que brinde una visión global de los datos moleculares estáticas y dinámicas. Esto tendrá un efecto directo relevAnce para estudios de biología celular, como el desciframiento de las modalidades sutiles que regulan la señalización intracelular y adicionales.
Descarga de MTT
El código fuente de MTT está disponible como software de código abierto para la investigación académica. Se puede descargar desde nuestra página web, en ciml.univ-mrs.fr , navegando a la página de nuestro equipo, El Laboratorio y Marguet, que proporciona un enlace para la descripción del software y la descarga. Tenga en cuenta que nosotros le pedimos su nombre y la institución sólo para la información, por ejemplo en el caso de una mayor colaboración o para informarle acerca de una nueva versión o actualización.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a los miembros de nuestro equipo, sobre todo Blache MC para la asistencia técnica, así como M Irla y Imhof B, por su apoyo y fructíferos debates. Las cifras de la deflación y el confinamiento reproducido por cortesía de Nature Methods. Este proyecto es apoyado por becas institucionales del CNRS, el INSERM y la Universidad de Marsella, y por ayudas económicas de la región de Provenza-Alpes-Costa Azul, Instituto Nacional del Cáncer, la Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, la ANR 2010 BLAN 1214 01) y Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR con el apoyo de una beca de la Ligue Nationale Contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
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| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
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| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
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References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M. Brownian motion in biological membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M. Enzymatic digestion of monoclonal antibodies. Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: effects of corrals. Biophys. J. 69, 389-398 (1995).
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C. Looking at lipid rafts. Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
