Summary
多目标跟踪是一个自制的算法跟踪单独标记分子在活细胞的细胞膜。有效地检测，估计和跟踪在高密度的分子随着时间的推移，提供一个用户友好，全面的工具来研究纳米膜动力学。
Abstract
我们的目标是获得细胞膜发生在不同的生物功能的分子过程的全面描述。我们的目标是在描述复杂的组织和细胞膜的动态，在单分子水平，开发的分析工具，专门在高密度单粒子追踪 （SPT）： 多目标跟踪 （MTT）1。电视显微镜，单分子提供毫秒级和纳米级分辨率1-11，允许膜组织12-14详细表示，通过精确映射，如细 胞受体的定位，流动性，禁闭或相互作用的描述。
我们重新审视六方会谈，实验和算法。实验方面包括：优化设置和细胞标记，以达到尽可能高的标签密度特别强调，为了提供一个分子动力学动态快照就这样发生在膜。算法的问题有关的每一步都用于重建的轨迹：峰值检测，估计和重新从15,16图像分析处理，通过特定的工具。实施后，检测通缩允许抢救峰最初隐藏相邻，峰强。值得注意的是，提高检测直接影响重联，减少内轨迹的差距。已评估使用各种标签密度和噪声值，这通常代表两个主要局限在高时空分辨率的并行测量的蒙特卡罗模拟表演。
17纳米的精度得到单分子，无论是连续使用开/关photoswitching或非线性光学，可以提供详尽的意见。这是19,20风暴18日 ，棕榈，RESOLFT 21 STED 22,23，WHI等17 nanoscopy方法的基础上CH可能常常需要固定的样品成像。中心任务是有限的单分子所产生的衍射峰的检测和估计。因此，提供足够的假设，如恒定的定位精度，而不是处理布朗运动，MTT法是直截了当地适用于纳米级的分析。此外，MTT法可以从根本上被使用在任何规模：不仅为分子，同时也为细胞或动物，例如。因此，MTT法是一个功能强大的跟踪算法，发现在细胞和分子尺度的应用。
Protocol
在这段视频中，我们提出了一个完整的单粒子追踪实验，利用量子点定位到一个特定的膜受体。这项实验的主要目标包括在鉴别不同类型的测量活细胞的细胞膜内的分子扩散行为。事实上，在膜产生的分子运动，通常可以从布朗扩散偏离线性指示或局限在nanodomains 26日至29日，例如。我们的目标，同时为许多技术上是可行的受体后，提供了在一个活细胞的细胞膜内发生的动力学产生的各种快照。这是最终有望使细胞表面的受体信号的调节机制破译。
1。细胞培养
- 准备细胞样品：使用附着COS-7细胞内源性表达的表皮生长因子受体（EGFR）30。何时与活细胞的工作，不用抗生素，确保有没有潜子检出污染，使用适当的无菌技术，在任何时候都在准备。
- 生长在细胞完全培养基（DMEM培养液，10％小牛血清，1％谷氨酰胺，肝素钠1％和1％丙酮酸钠，见下面的特定试剂的表），在37°C，7％的CO 2，照顾，让他们分合流，之前他们在Lab-Tek的传播呈指数增长。
- 实验前的一天，传播5000细胞/以及在8室（实验室TEK）孵育过夜。计数细胞，保证了恒定的细胞密度，因此每个细胞中的量子点的重现率。
2。细胞标记
量子点准备与一个特定的涂层。量子点是半导体荧光纳米粒子组成。这些纳米粒子呈现出高息，因为它们是非常明亮，耐光古典荧光探针31,32，这使得单分子成像成就一个适当的信号噪声比（SNR）。
- 实验前，产生杂交瘤细胞株（108单克隆抗体，ATCC HB - 9764）针对表皮生长因子受体的Fab片段与木瓜蛋白酶消化，如前面所述21。
- 共轭厂与生物素，为制造商的说明（EZ链接磺酸基NHS-LC-生物素包; Thermo Scientific的， 图1A）。
- 使用功能在605纳米（最佳发射波长的辉煌，从细胞自体荧光检测和分离）与链霉亲和素（Invitrogen公司）和发光的量子点。
- 准备在完全培养基的标签解决方案（见特定试剂的表），以饱和的streptavidins目前量子点周围，以及防止聚集和非特异性结合到细胞和盖玻片。
- 准备两个中间的解决方案：量子点 - 亲和另一个与生物素厂之一，在20纳米之一。
- 混合等量的这两个解决方案：在1:1的比例混合厂的量子点，获得最后的工作浓度为10纳米晶圆厂：量子点复杂。使用摩尔比，有利于形成一个量子点和一个生物素化的Fab片段组成的单官能络合物。这有利于单价标签，由于受体交联33,34限制工件的意见。
- 在25°C孵育15分钟，每分钟1200转振动筛，以防止聚集。混合，然后准备使用活细胞。
- 在37℃孵育细胞100μL混合5分钟，7％的CO 2。
- 用细胞非萤光成像介质（HBSS中的缓冲区，1％肝素钠，看到表的特定试剂）预温37°C。
- 仔细去除多余的标签，以防止联合国必要通过绑定破坏信噪比，重点量子点，通过广泛与成像介质，在室温下通常为5倍延迟至少5分钟前，最后一次洗涤洗涤每口井。
3。光学装置
视频显微镜设置四个主要部分组成：
- 倒置显微镜与一个特定的荧光立方体（FF01-457/50激励，FF495-Di02分色，FF01-617/73排放过滤器，Semrock）和高数值孔径（1.3或1.49）油浸泡100X目标。
- 一个100瓦汞灯（通过光纤耦合到显微镜，避免干扰与体温）。
- 512 x 512像素高灵敏度EMCCD相机达到了足够的信噪比。
- 孵化器保持在37°C，在实验过程中的生物样品。
4。获得
- 选择孤立和传播良好的细胞。这利于延长不错，平坦的伪足，最适合寻找分子膜的平面运动，。
- 评估细胞的生理状态，其外观都在透射光荧光：紧张水疱交通，坏死或凋亡的迹象，低自体荧光，平均强大的量子点标记（通常高达1000每单元量子点的情况下，请参阅图1b）。
- 选择一个高的标签密度，同时监测尽可能多的受体是至关重要的。这实际上是有限的生理（表面的表达，抗原无障碍，横向运动）和算法参数（非重叠的点扩散函数（PSF），即使考虑到由于议案的帐户模糊，允许适当的检测和重新连接）。
- 对于每一个细胞，首次获得明场图像（优先使用，DIC，如果有的话），可以进一步让检查细胞方面和空间限制的lamellipodia。
- 保存该图像，视频栈（如例如cell1.tif及cell1.stk）使用相同的名称，在名为DIC的一个子文件夹，因为，这些公约，该算法可以自动找回来的图像匹配每个堆栈。
- 收购每单元1至3部影片，连续，通常在36毫秒率，以最快的速度在全画幅，这台相机实现。但是人们可以获取更高的频率，可达1毫秒率，使用专用的CCD具有更高的灵敏度和/或更少的像素。帧传输技术，提供帧之间的延迟可以忽略不计。
- 电子乘法增强应始终设置为最大（仅低于饱和，如果有关的话），可以达到单个分子的敏感性，有足够的信噪比，至少超过20分贝（高效的峰值检测1），通常约为25-30分贝。
- 通常情况下获得300帧，每部影片，罪CE轨迹〜100帧平均多长的闪烁事件的限制，重建了。视频频率和长度可以适应一个给定的措施，例如可能需要更长的痕迹。
5。 MTT法分析
- 目录中包含的视频文件与Matlab或倍频评价一个给定的数据集选择的路径。
- 要启动的完全自动化的分析1,35，键入精明，或MTT23i在Matlab命令detect_reconnex23。这个方案表示“2.3版本的用户界面，”可供下载，与以前的2.2版本。它首先显示的图形界面，列出所有使用的参数， 如图所示。 2。
6。代表结果
MTT法自动分析每个视频录像机，实现目标的检测和估计的痕迹，进一步补充如坐月子检测vestigations。这最终使细胞图像（ 图1C＆3）映射的痕迹。
MTT法说明
核心MTT法进行了每一帧，调用3（ 图3）主要任务：
- 作为一个双维高斯峰：存在存在或没有一个目标（量子点），在滑动分区域先后围绕每个像素的中心，其中两个假设进行了比较，无论是信号检测与PSF模型化，或唯一的噪音，投保足够低的误报的一个门槛，用虚假检测不到百分之一帧。这将导致检测概率图。被认为是一个假定的目标，每个地方的最高投保，其概率是根据所需的误报警（PFA）的概率，比最低值高。此限制设置得足够低，有效地辨别信号噪音花费较长时间，避免在（10-6 PFA默认情况下，以保证在512×512像素的图像误差不到一）虚假检测，同时仍然允许足够高的检测概率，达到了理论预测最佳1。需要注意的是，使用一个分区域的要求意味着，图像边界（3个像素，为7×7像素的默认窗口）无法评估。
- 估计，对有关参数，如亚像素位置和信号强度，每个检测到的目标。对于每一个检测到的目标，最小二乘高斯 - 牛顿适合未来执行估计检测高斯的位置，宽度和高度。这提供了显着的染料的亚像素位置（10至20纳米精度典型的SNR值和静止或缓慢扩散的染料，增加染料在0.1微米的2 / s的扩散到约100 nm）。
- 重联的新目标已建成超过前一帧的痕迹。以前的痕迹，再配上一套新的目标。为此，为了给每个目标跟踪，如果可能的话，使用所有可用的统计资料，从检测步骤获得，不仅地位，但也强度，宽度，闪烁和相关的统计。因此，目标不只是分配到最近的痕迹：在过路的痕迹，强度，速度，宽度和闪烁的情况下将被视为。这也提供了统计最优的重联得分。此策略避免了可能的时候，向近邻偏置重联。
检测峰可以拒绝，如果他们的估计或重新连接失败后验。一个特殊的测试处理检测新的高峰，这将启动新的痕迹。本试验采用更严格的PFA（10-7），自重新高峰跟踪验证Ø可以解释为事实上 f的相关性（这个标准定义不适用新的高峰）。
轨迹分析
未来可能短暂监禁评估当地扩散24-29负相关的功能。应用门槛，允许定义限制或不发作。通过遍历所有的痕迹，我们可以将膜动力学，在短暂的禁闭/放慢事件。这可以交替使用二进制或本隔离指数的离散值代表。
默认情况下，MTT法自动执行这些任务，保存在一个文本文件中的8个峰参数：车架号，i和j的位置，信号强度，半径，偏移和闪烁每个视频帧（组7行）和微量元素（列）， 。这些输出参数，可以重新使用Matlab或倍频fread_data_spt脚本，为进一步分析即走线或信号强度，作为体现在 “http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt”> MTT_example脚本附录。
进一步的分析，导致映射的每个单元的痕迹（ 图1C），并提供相关参数（如峰值强度，信噪比或局部扩散值）直方图分布。对于每个文件，平均每个参数的标准偏差都保存在一个文本文件，图像的直方图。对数分布，如R 2平方位移，导致以几何平均数。从以上的MSD曲线的第一个五点的线性拟合计算的扩散系数D。这些值涉及细胞反应或影响膜组织的制药/酶处理的例子动力学实验提供了一个概述。由于MTT法是一个开放的源代码，这方面可以很容易适应任何专门的调查。
599fig1.jpg“ALT =”图1“/>
图1。膜受体的动态监测采用MTT。（一）膜元件，如表皮生长因子受体，与生物素化的Fab片段（约正确的，每个分子尺度的示意图）耦合量子点标记。 （二）典型的荧光图像获得从现场的COS-7细胞，用36毫秒的曝光时间，描绘有限衍射峰对应的个别标记的受体。 （三）MTT法显示输出受体重组后的轨迹，对细胞的明图像覆盖。
图2。 MTT法输入参数。运行MTT23i打开图形用户界面，列出所有的输入参数，名称和默认值，在我们以前出版1。在算法，空间和时间参数（搜索窗口，峰值半径，最大扩散闪烁）是无量纲的标准单位，像素和帧。校准可用于事后转换输出结果。默认值，相应的一个梯级512BFT 100X倍率，像素大小：156海里/ PXL和帧延迟：36毫秒/帧。
调查人员应优化几个关键参数，如预期的最大扩散系数（“变化最大”）和最大闪烁失踪（“T OFF”）。这两个时间和空间的限制，几乎是唯一的，需要重新考虑，对于一个给定的实验条件下，健壮的默认值被设置为其他的。例如，误报的数量直接设置，以确保每万像素不到一个错误，因此比每一个框架，这在大多数情况下是令人满意的。所有参数都保存在一个文本文件输出文件夹中，让用户核实后的设置被用于分析。
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg“ALT =”图3“/>
图3。 MTT法的主要步骤。从实验的荧光图像栈开始，峰顺序，并自动检测，估计高斯拟合和多帧重新连接（第一的经营范围，上部流程图）。假定禁闭的痕迹可以进一步加以分析，例如，最终导致了相关描述（第二经营范围，下部）的动态地图。
图4。标签价不会影响MTT法评估可能的偏差，通过人工的多价标签介绍，MTT法进行跟踪标签使用2个不同的方案，以生成和分析的轨迹图的内源性表皮生长因子受体。 （A）受体与生物素化的Fab和量子dots605的 - 亲标签，在协议中所述。在这种情况下，量子点和streptavidins多价可能会导致在一个单一的染料耦合几个受体。 （二）受体标记直接耦合到一个有机染料，Atto647N晶圆厂。在这种情况下，一个晶圆厂，因此一个受体，可以再加上一个以上的染料。 （三）平均平方位移（MSD）的曲线，计算出每个单元的所有痕迹，标记与量子点或阿托染料（左边和右边的图形，分别）。超过五个第一的MSD（红色虚线）点的线性拟合计算扩散系数。每个标签导致类似的扩散值（图中央）的计划。 qdot：量子dots605（N = 5个细胞），阿托：Atto647N（N = 7细胞），NS：不显着（学生t检验P值> 0.05）。
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Discussion
旁边的细胞和显微镜的各个方面，在单粒子跟踪，分析代表了相当一部分的工作。这解决了算法用于执行三大任务：检测，评估和重新连接了每帧的山峰。但随之而来的这项工作方面驻留在拟订算法本身，这可能需要适应任何新的专门调查，基本上最后，额外的步骤（如破译运动模式，相互作用或化学计量学）。
然而，一旦该算法充分开发，运行，它是简单的，特别是因为我们付出的输入参数的数量保持在最低（ 图3）注意。这使得MTT法非常强大的，易于实现。制定MTT法时，我们的目的完全重新考虑每个任务所用的分析选项。我们要优化过程中，沿着两个具有挑战性的轴：
- 处理机智h高密度标签提供在长期的细胞表面采样空间的详细信息。理想的情况下，一会尝试遵循一个几乎完整的分子人口，同时，为了获得一个全面的观察。然而，如此详尽的标签会导致类似古典通过免疫获得的图像，而不单分子决议，强烈的，因为所有的标签重叠由于衍射。对于典型的分子数（即〜10 5受体30细胞）和细胞大小（即〜30微米），如果我们假设均匀分布，分子间的平均距离约100 nm。采集过程中的扩散也有利于传播PSF的可比程度：通常在30毫秒〜100纳米0.1微米的2 / s的布朗运动。值得注意的是，这种传播是平均各向同性，因此仍然会产生高斯像涤纶短纤。因此，高达10％的人口可以从理论上检测，因为这将LEAd到〜300纳米，兼容与衍射和运动限制的平均距离。然而，这需要会计调制在空间分布的不均匀性，标签的限制（如立体约束，抗原无障碍等），增加和无法解决的冲突甚至因交叉轨迹，整体检测效率。实验中，我们可以达到和准确地监测了总人口的很大一部分，密度〜1000宽80微米领域内的标签。这个上限从个别检测需要一个详尽的空间测量（ 见图1C欣赏细胞表面的空间采样）的目标之间的妥协结果。
- 处理最弱的可能信噪比允许无论是在低光照成像，细胞的活力，和/或高的速度，它提供了更好的时间信息是有利的。然而，这意味着较低的信号每幅图像，由于较低的收集光子的数量。请注意，在最短的时间实现EMCCD相机（1毫秒）出现对应适当的检测和MTT法估计可接受的最低信噪比（20分贝）。
标签价是在单分子研究的经常性问题。事实上，染料/目标比例的直接措施是极具挑战性的34。然而，调查推定偏见介绍，通过人工的多价标签的替代方法包括比较措施以量子点标记（每染料公认的几个目标，诱导不真实的交联）或有机染料标记（，相反，一些公认的染料每个目标，偏置只有信号强度和漂白特性）。我们和其他6,36,37观察可比行为时，使用任何量子点或有机染料（atto647N在我们的例子中，图4），扩散和莫之间的过渡条款DES的议案。在这两个条件之间的扩散值的变化是低于细胞细胞之间的差距（ 图4C）。这说明，标签价，即使没有严格的单价，没有显着影响SPT的结果。
分娩和分子间的相互作用
瞬时或稳定的约束可以解释为优惠亲和力的签名或互动24-29。生物膜确实强烈不均匀，如疏水性，跨膜大小和界面张力的结构特点决定的地方议会。这些驱动力，导致时空重塑的功能组件，即信号的关键作用，粘连或贩卖。测绘和量化等事件，预计将提供一个关键破译细胞如何整合不断提出刺激。事实上，一个单元，表现出充分适应，通过精确的响应REQuires调整信令合作伙伴和他们的环境之间的相互作用。子膜细胞骨架的栅栏，膜结构，如吞坑或局灶性粘连，或也proteic /脂的合作伙伴参与信号实例域，膜受体相互作用。我们表示，此类事件，可以追究通过禁闭实力和其在空间和时间的变化。这进一步增强了工作在实现最高的空间，时间分辨率，牢记相关短的时间，和高密度的限制，正如上面所讨论的重要性。
互补技术
这是一个很好的做法，与其他方法比较等动态测量。例如其他动态显微技术，如FRAP还原和FCS，提供互补的灵敏度和分辨率4,38,39。 FRAP还原提供了一个合奏测量分子扩散，而FCS可以达到小号英格尔分子灵敏度，具有很好的时间分辨率。然而，这两种方法本质上是限于本地措施（通常在聚焦点）。这促使我们采取的优势，推动SPT的空间可能性的限制，调查的大视场，一次涵盖整个细胞，与当地有关的时空精度。
进一步发展和调查
据MTT法，可使用单分子的测量解决生物学问题的范围，可以沿各个方向扩展，在每个级别的检测，估计，重新连接，并进一步分析。例如，可以考虑处理多个分子群体，要求多色检测 - 可以使用专用的光纤或分析计划执行。估计可以包括新的相关描述，如任何光谱或极化信息，或轴向z位置，扩展到40 3D跟踪。
重新连接，可以完全重新布朗和闪烁的假设为一个具体问题。有趣的是，测量单分子在过去十年中一直延伸到所谓的纳米级政权17,22,23。 MTT法虽然是直接寻址单分子定位，这是考虑到一个固定样本的情况下，它提供了一个详尽的分子人口本地化的安全解决方案至关重要。然而，在这种情况下，布朗的假设不再有效。更换1纳米级的措施，只限于由信噪比，准确地处理，它是为达到最好的纳米级分辨率的关键。
沿着这样的发展，无论是多色，3D和/或详尽的措施，预计今后的工作中分子的静态和动态数据提供一个全面的看法。这将有一个直接的站长的审核为细胞生物学的研究，如破译额外的细胞内信号调节的微妙的方式，ANCE。
下载MTT法
MTT法的源代码是作为学术研究的开源软件。它可以从我们的网页下载，在ciml.univ-mrs.fr导航到我们团队的页面，他＆Marguet实验室，它提供了一个为软件介绍和下载链接。请注意，我们问您的姓名，只为信息机构，例如在进一步开展合作的情况下，或告知你一个新的版本或更新。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢我们的团队成员提供技术援助，特别是管委会Blache，以及M Irla和乙Imhof，对他们的支持和富有成效的讨论。通缩和分娩的数字再现自然方法提供。支持这个项目是由国家科学研究中心（INSERM）和马赛大学，体制补助和特定地区研究所国家杜癌症，法新社国立德拉Recherche（普罗旺斯 - 阿尔卑斯 - 科特迪瓦-d'Azur补助的ANR-08-PCVI 0034-02，国家情报局2010汪曾祺1214 01）基金会争取，LA RECHERCHEMédicale（队报labéliséeFRM-2009）。 VR是支持从法甲国立CONTRE LE癌症的奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
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