Summary
複数のターゲットトレースは、生きた細胞の細胞膜内で個別に標識分子を追跡するために開発した自家製のアルゴリズムである。効率的に検出するナノ膜のダイナミクスを調べるためにユーザーフレンドリーな、包括的なツールを提供し、高密度で時間をかけて分子を推定し、トレースします。
Abstract
私たちの目標は、異なる生物学的機能における細胞膜で起こる分子プロセスの包括的な説明を得ることである。 複数のターゲットトレース （MTT）1：我々は、高濃度で単粒子追跡 （SPT）に専用の分析ツールを開発することによって、単一分子レベルでの複雑な組織や細胞膜のダイナミクスを特徴付けるを目指しています。ミリ秒とナノ分解能1-11を提供する単一分子ビデオ顕微鏡は、正確にそのような細胞受容体の局在化、モビリティ、監禁や相互作用などの記述子をマッピングすることにより、膜組織12月14日の詳細に表現することができます。
我々は両方の実験とアルゴリズム、SPTを再訪。実験的な側面は、分子動力学の動的スナップショットを提供するために、可能な限り最高の標識密度に到達する上で特に重点を置いて、最適セットアップおよび細胞標識が含まれていのそれは膜内に発生します。ピーク検出、推定と再接続、画像解析15,16から、特定のツールによって対処：アルゴリズムの問題は、軌道を再構築するために使用される各ステップを懸念。検出後にデフレを実装するには、救出のピークは最初に隣接する、強力なピークによって隠さことができます。注目すべきは、検出を改善することを直接軌道内のギャップを減らすことによって、再接続に影響を与えます。性能は一般的に高い時空間分解能での並列測定のための2つの大きな制約を表すさまざまなラベリング密度とノイズ値に対してモンテカルロシミュレーションを用いて評価されています。
photoswitchingまたは非線形光学オン/オフどちらの連続を使用して、単一分子で得られたナノメートル精度17は 、徹底的な観測を提供することができます。これは、STORM 18、PALM 19,20、RESOLFT 21またはSTED 22,23、WHIとしてnanoscopy方法17の基礎であるchは、しばしばイメージング、固定のサンプルが必要な場合があります。中央のタスクは、単一分子から発せられる回折限界のピークの検出および推定である。したがって、そのような一定の位置精度の代わりにブラウン運動を扱うように十分な前提を提供し、MTTは、素直にナノスケールの分析に適しています。また、MTTは、基本的にどのような規模で使用することができます。分子のだけでなく、細胞や動物のために、例えば。したがって、MTTは、分子や細胞スケールでアプリケーションを見つける強力な追跡アルゴリズムである。
Protocol
このビデオでは、我々は特定の膜受容体を標的と量子ドットを使用して、完全な単一粒子追跡実験を提示します。この実験の主な目的は、生細胞の細胞膜内で測定した分子拡散挙動の識別異なる種類で構成されています。確かに、膜に生じる分子の動きは一般的に直線的に例えば26から29ナノドメイン内の指示または密閉されることによって、ブラウン拡散から逸脱することができます。我々は、生細胞の膜内で発生するダイナミクスで生じる様々なスナップショットを提供するために、同時に技術的に可能な限り多くの受容体として以下を目指しています。これは最終的に細胞表面受容体のシグナル伝達を調節するメカニズムの解読できるように期待されています。
1。細胞培養
- 細胞のサンプルを準備します。付着したCOS-7内因性上皮成長因子受容体（EGFR）30を発現する細胞を使用しています。時抗生物質なしで生細胞での作業は準備中にすべての回で適切な無菌テクニックを使用することによって隠れたサブ検出可能な汚染がないようにしてください。
- その中を持って世話をして、7％CO 2で37℃、完全培地（10％子牛血清を含むDMEM、1％グルタミン、1％HEPES、1％ピルビン酸ナトリウムは、以下の特定の試薬 の表を参照）で細胞を成長させるラボ·テックでそれらを拡散する前に、サブコンフルエント、指数関数的成長。
- 実験前日、8ウェルチャンバー（LAB-TEK）でよく/ 5,000細胞を広げ、一晩インキュベートする。カウント細胞が故に一定の細胞密度、細胞当たりの量子ドットの再現率を保証します。
2。細胞標識
特定のコーティングを施した量子ドットを準備します。量子ドットは、半導体から成る蛍光ナノ粒子である。彼らは古典に比べて非常に明るく、光安定であるため、これらのナノ粒子は高い金利を提示単一分子イメージングのための雑音比（SNR）に適切な信号の達成を可能にする蛍光プローブ31,32、。
- 実験前に、前述の21としてパパインで消化し 、ハイブリドーマ細胞株からEGFR（MAB 108、ATCC HB-9764）に対するFabフラグメントを生成します。
- メーカーの指示に従って、ビオチンとの結合体は、Fab、（EZ-リンクスルホ-NHS-LC-ビオチン化キット、サーモフィッシャーサイエンティフィック、 図1A）。
- 605 nmの（細胞自家蛍光から輝き、検出および分離するための最適な発光波長）でストレプトアビジン（Invitrogen社製）と発光で官能量子ドットを使用しています。
- 量子ドットの周りに存在ストレプトアビジンと同様に、凝集し、細胞へとカバースリップへの非特異的結合を防ぐために飽和するためには、（特定の試薬の表を参照）完全培地中での標識溶液を調製します。
- 二つの中間ソリューションを準備します。量子ドット - ストレプトアビジンとビオチン化は、Fab、20 nMのそれぞれに別のものと1。
- これら2つのソリューションの等量を混ぜる：量子ドット複合体：10nMのFabの最後の仕事濃度を得るために1:1の比率のFabを持つ量子ドットを混在させること。等モル比を使用すると、1つの量子ドットと1ビオチン化Fab断片で構成されるモノ官能化複合体の形成に有利である。これは、受容体33,34を架橋に起因するアーティファクトの観測を制限して、一価の標識を支持する。
- 凝集を防ぐために、毎分1,200回転でシェーカーを使用して、25℃で15分間インキュベートします。ミックスはその後生きている細胞に使用できるようになりました。
- 7％CO 2で37℃で5分間混合液100μlで細胞をインキュベートします。
- 非自己蛍光イメージング媒体（HBSS緩衝液、1％HEPES、特定の試薬の表を参照してください）37℃で温め℃で細胞を洗浄
- 国連を防ぐために慎重にラベルの過剰を取り除く必要に応じて、広範囲のイメージング媒体、最後の洗浄の前に少なくとも5分の遅延、室温で一般的に5回、各ウェルを洗浄することにより、ピントが量子ドットの、バインドされていないことでSNRを損なう。
3。光学装置
ビデオ顕微鏡のセットアップは、次の4つの主要部分で構成されています。
- 特定の蛍光キューブ（FF01-457/50励起、FF495-Di02ダイクロイック、およびFF01-617/73発光フィルター、Semrock）と高開口数（1.3または1.49）油浸100倍を目的とした倒立顕微鏡。
- 100 W水銀ランプ（体温調節に干渉を避けるため、光ファイバを介して顕微鏡に結合された）。
- 512×512ピクセルの高感度は、十分なSNRを達成するためにカメラをEMCCD。
- 実験中に37℃での生物学的サンプルを保つためにインキュベーター。
4。買収
- 孤立したとよく拡散セルを選択します。この最高の膜分子の平面運動を探しに適応良い、平坦な葉状仮足の拡張を支持する。
- 透過光と蛍光の両方で、その外観によって、細胞の生理状態を評価する：強烈な小胞輸送、壊死またはアポトーシスの兆候の有無、低自家蛍光、および平均の強力な量子ドット標識（通常はセル当たり最大1,000量子ドットを参照してください図1B、C）。
- 同時にできるだけ多くの受容体として監視するために重要である高い標識密度を選択します。これは実際に両方の生理的な（表面発現、エピトープのアクセシビリティ、横方向の動き）と、アルゴリズムのパラメータ（たとえ適切な検出および再接続を可能にするために、運動によるアカウントのぶれを考慮して、重複しない点広がり関数（PSF）、）によって制限されます。
- 各セルは、最初のさらなるセルの側面をチェックし許可することができます明視野像を（可能であれば優先的に、DICを使用して）を取得と葉状仮足の空間を制限します。
- これらの規則で、以来、DICという名前のサブフォルダに、ビデオ·スタック（例えばcell1.tif＆cell1.stkなど）と同じ名前を使用して、このイメージを保存すると、アルゴリズムは自動的に一致する画像を再生見つけることができます各スタック。
- 通常は36ミリ秒の速度、このカメラでは、フルフレームで達成可能な最も速い速度で、連続して、セルごとに1から3の動画を取得します。しかし、1が増加し感度および/または以下の画素と、専用のCCDを使用して、最大1 msの速度に、高い周波数で取得することができます。フレーム転送技術は、フレーム間のごくわずかの遅延を提供します。
- 電子乗算強化は、常に一般的に25〜30デシベルの周囲に、少なくとも20デシベル（効率的なピークの検出1）の上、十分なSNRと、単一分子感度に到達できるように、（ちょうど飽和以下、該当する場合）、最大に設定する必要があります。
- 通常、ビデオ、罪あたり300フレームを取得するCEの軌跡は、ほとんどが長い点滅するイベントによって制限され、平均で約100フレームを介して再構築されます。ビデオ周波数と長さは、例えば長いトレースが必要になる場合があります与えられた測定値に対して適応させることができます。
5。 MTT分析
- MatlabやOctaveは、与えられたデータセットを評価するためにビデオファイルを含むディレクトリへのパスを選択します。
- 完全に自動化を分析1,35を起動するには 、Octaveでコマンドdetect_reconnex23を入力するか、MatlabのMTT23i。このプログラムは、 "ユーザーインターフェイスを備えた、バージョン2.3"の略で、以前のバージョン2.2と一緒に、ダウンロードすることができます。それは、最初の図に示すように、使用されるすべてのパラメータを一覧表示するグラフィックインターフェースを表示します。 2。
6。代表的な結果
MTTは、自動的にさらに補完、検出されたと推定ターゲットのトレースを実現するために、各レコーダーの映像を分析し、このような閉じ込め検出などvestigations、。これは最終的に細胞の画像（ 図1C＆3）を介してマッピングをトレースすることができます。
MTTの説明
コアMTT分析は主に3つのタスクを実行します（ 図3）を呼び出し、各フレーム上で実行されています。
- PSFは双方向次元ガウスピークとしてmodelizedのいずれかの信号の存在下で、二つの仮説を比較して連続して各ピクセルを中心としたスライディングサブ領域、内のターゲット（量子ドット）の有無の検出 、 、またはフレームあたり1つ未満のスプリアス検出と、十分に低い誤警報を保証するしきい値を使用してノイズだけ、。これは、検出確率のマップにつながる。それぞれの極大は、その確率レベルが誤警報（PFA）の所望の確率に応じて設定する最小値よりも高いことを保証する、推定対象と見なされます。この制限は、効率的な信号を識別するのに十分低く設定されていますノイズからnals、依然として検出が十分に高い確率を許可しながら、理論的に予測、最適な1に達し、最高のスプリアス検出（デフォルトでは10 -6のPFA、512×512ピクセルの画像が少ない複数のエラーを確実にするため）で回避できます。サブ領域を使用しての要件は、イメージの境界（7×7ピクセルのデフォルトのウィンドウの3つのピクセルが、）を評価することができないことを意味することに注意してください。
- そのようなサブピクセルの位置や信号強度などの関連パラメータの推定、検出された各ターゲットの、。すべての検出されたターゲットに対して、最小二乗ガウス·ニュートン近似は次の検出されたガウス分布の位置、幅と高さを推定するために実行されます。これは特に色素のサブピクセル位置（代表的なSNR値と動かない、または徐々に拡散染料の10から20 nmの精度が0.1μm2 / sで拡散染料のために〜100 nmまで増加する）を提供します。
- を持つ新しいターゲットの再接続トレースはすでに前のフレーム上に構築。新しいターゲットのセットは、以前のトレースのセットと照合されます。この目的のために、可能であれば、トレースに各ターゲットを割り当てるために、検出工程から得られる利用可能なすべての統計情報は、位置だけでなく、強さ、幅、点滅すると、関連する統計だけでなく、使用されます。したがって、目標は単に最寄りのトレースに割り当てられていない：交差トレース、強度、速度、幅と点滅の場合には考慮されます。これは統計的に最適な再接続のスコアを提供しています。最寄りの隣人に向かって再接続をバイアス可能な場合は、この戦略は、避けることができます。
検出されたピークは、推定または再接続が失敗した場合は拒否された事後にすることができます。特別なテストでは、新しいトレースを開始するような新しいピークの検出を処理します。このテストは、より厳格なPFA（10 -7）を使用してトレースにピークを再接続するので、検証oとしてデファクトと解釈することができます Fとの関連性（この基準は、新たなピークには適用されない定義である）。
流跡線解析
可能な一時的な閉じ込めは、次の反比例ローカル拡散24から29に関連した関数によって評価されています。しきい値を適用すると、閉じ込められたかどうかのエピソードを定義することができます。すべてのトレースを介してこれらを繰り返すことにより、我々は一時的な閉じ込めの観点から/イベントを遅くし、膜のダイナミクスをマッピングすることができます。これは、代わりにバイナリまたはこの閉じ込めインデックスの離散値のいずれかを使用して表現することができます。
各ビデオフレーム（7行のグループ）とトレース（列）のフレーム番号、iとjの位置、信号強度、半径、オフセットと点滅し、デフォルトでは、MTTは自動的に8ピークテキストファイル内のパラメータを保存し、それらのタスクを実行します。 。に例示したように、これらの出力パラメータは、MatlabやOctaveはさらにすなわちトレースまたは信号強度を解析するためfread_data_sptスクリプトを使用して再ロードすることができます付録の"http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_exampleスクリプトを実行します。
さらなる分析は、各セルの上にトレースをマッピングする（ 図1C＆3）と、関連するパラメータ（例えば、ピーク強度、SNR、またはローカルの拡散値など）のヒストグラム分布を提供するために導く。各ファイルについて、各パラメータの平均値と標準偏差は、一緒にヒストグラムのイメージで、テキストファイルに保存されます。そのような正方形の変位R 2のように対数のディストリビューションでは、幾何平均につながる。拡散係数Dは、MSDカーブの5最初のポイント上に線形近似から計算されます。これらの値は、細胞の反応や膜組織に影響を与える医薬品/酵素処理の例では、動力学のために関連する実験の概要を説明します。 MTTは、オープンソースのコードであるため、この側面は、容易に任意の専用調査に適合させることができる。
599fig1.jpgの "alt ="図1 "/>
図1。 MTTによる細胞膜受容体の動態を監視するなど EGFR（）の膜成分は、ビオチン化Fabフラグメント（各分子の約正しいスケーリングの模式図）に結合量子ドットでタグ付けされます。 （B）典型的な蛍光画像を個別に標識した受容体に対応する回折限界のピークを描いた、36ミリ秒の露光時間で、ライブCOS-7細胞から得られた。 （C）MTT分析の出力は、細胞の明視野画像上に重ね受容体の再構成軌道を、表示されます。
図2。 MTTの入力パラメータを設定します。実行MTT23iは私達の前の出版物1に記載したようにすべての入力パラメータ、名前とデフォルト値を、リスト、グラフィックユーザーインターフェースを開きます。アルゴリズム、空間と時間のパラメータ（検索窓、ピーク半径、最大の拡散にと点滅）無次元標準ユニット、ピクセルとフレームにあります。キャリブレーションは、出力結果を変換するための事後適用することができます。 156 NM / PXLとフレーム遅延：36ミリ秒/フレーム100倍のカスケード512BFTに対応するデフォルトの値は、ピクセルサイズです。
調査官は、そのような予想される最大の拡散係数（ "差分MAX"）と最大点滅消失（ "T オフ "）のようないくつかの重要なパラメータを最適化する必要があります。これら二つの空間と時間の制限はほとんど与えられた実験条件、堅牢なデフォルト値に設定されている他人のために再検討する必要がある唯一のものです。例えば、偽アラームの数を直接ほとんどの場合十分であるフレームごとに1つ、より少ないので万画素未満つのエラーを確認するために設定されています。すべてのパラメータは、ユーザーが分析のために使用された設定を後で確認することができ、出力フォルダ内のテキストファイルに保存されます。
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpgの "alt ="図3 "/>
図3。 MTT分析の主要な手順を実行します。蛍光画像の実験スタックから始めて、ピークが連続しており、自動的に検出し、フレーム（操作の最初の範囲、フローチャートの上部）を介してガウシアンフィットして、再接続することによって推定した。トレースは、さらに最終的に、関連する記述子の動的マップ（操作の第2の範囲、下部）につながる、例えば、推定される閉じ込めのために分析することができます。
図4。ラベリング価は、MTTには影響しません。artefactual多標識によって導入された可能性バイアスを評価するために、MTT分析は、軌跡のマップを生成し、分析するために、2つの異なる方式を使用してタグ付けされ内因性EGFRを追跡するために行われた。プロトコルで説明したように（A）受容体は、ビオチン化Fabおよび量子dots605-ストレプトアビジンでタグ付けされた。このケースでは、量子ドットとストレプトアビジンの多価は、単一の染料にいくつかの受容体を結合する可能性があります。 （B）受容体を直接有機色素、Atto647Nに結合したFabでタグ付けされた。このケースでは、1は、Fab、それ故に1受容体は、複数の色素に結合させることができる。 （C）の平均二乗変位（MSD）曲線は、量子ドットやアト染料（左と右のグラフは、それぞれ）のいずれかで標識し、各セルのすべてのトレースに対して計算された。拡散係数は、MSDの5最初のポイント（赤い点線）上の線形近似で計算された。類似した拡散値（中央のグラフ）につながったラベリングの各スキーム。 Qdot®標識：量子dots605（N = 5細胞）を、アト：Atto647N（n = 7の細胞）、NS（スチューデントt-検定のp値> 0.05）に有意ではない。
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Discussion
単一粒子追跡では、セルと顕微鏡の側面の横に、分析の作業のかなりの部分を表しています。各フレームの上に、検出し推定し、再接続のピーク：これは、3つの主要なタスクを実行するために使用されるアルゴリズムに対応しています。しかし、この作業の結果としての側面は、最後に、余分な手順（例えば、運動、相互作用や化学量論のモードを解読など）のために本質的には、任意の新しい専用の調査のために適合させる必要があるかもしれませんアルゴリズム自体を起草に格納されています。
しかし、いったんアルゴリズムが完全にそれは我々が最小値（ 図3）で入力パラメータの数を維持するに注意を払って、特に以来、簡単で実行し、開発されています。これは、MTT非常に堅牢かつ簡単に実装できるレンダリングします。 MTTを起草するとき、我々は完全にそれぞれのタスクに使用される分析オプションを再考することを目指した。我々は2つの挑戦的な軸に沿ってプロセスを最適化したい：
- ウィットを扱うラベリングのh高い密度は、細胞表面のサンプリング期間の詳細な空間情報を提供します。理想的には、包括的な観測値を得るために、同時にほぼ完全な分子集団をフォローしようとします。すべてのラベルが強く回折による重複しかし、このような徹底的な標識は、単一分子の解決なしに、古典的免疫蛍光法により得られたものと似たイメージにつながる。典型的な分子の数（すなわち〜10 5セル30による受容体）と細胞の大きさ（すなわち〜30μm）を、我々は均一な分布を仮定すれば、平均分子間距離が約100 nmである。 30ミリ秒の間に典型的に約0.1μmの2 / sでのブラウン運動のために100nm以下：買収時の拡散にも匹敵する程度にPSFを拡散に貢献しています。注目すべきは、この拡散は、平均で等方性であり、したがって、まだガウスのようなPSFを生成します。したがって、人口の10％までは、理論的にこれでしょうLEAので、検出することができた〜300 nmの平均距離dは、回折や動きの制限と互換性があります。しかし、これは、（そのような立体制約、エピトープのアクセシビリティなど）の制限をラベリング増加し、交差軌跡、全体の検出効率のためにも解決できない紛争、空間分布の不均一性の会計処理により変調する必要があります。 80μmの幅の視野内〜1000ラベルの密度で、全体の人口のかなりの割合を実験的に、我々は達する可能性があると正確に監視します。個々の検出の必要性と網羅的な空間の測定（ 図を参照してください。1Cは、細胞表面の空間サンプリングを鑑賞する）の目標の間で妥協点から、この上限値の結果。
- 弱い可能なSNRを処理することで細胞生存率、および/またはそれ以上の時間的な情報を提供する、高速でのために有益である低照度、のいずれかでイメージングすることができます。しかし、これは低信号を意味する収集された光子数が少ないために当たり画像、。 EMCCDカメラ（1ミリ秒）で達成可能な最短のタイミングがMTTによる適切検出および推定のための最小許容SNR（20 dB）に対応するように表示されていることに注意してください。
ラベリング価は、単一分子の研究で、再発の問題です。確かに、染料/ターゲット比の直 接測定は、高度34を挑戦している。しかし、artefactual価ラベルによって導入された推定上のバイアスを調査するための代替方法は、量子ドットのタグ（染料ごとに推定されるいくつかのターゲットで、artefactual架橋を誘導する）、または有機色素タグ（と、逆に、推定されるいくつかの染料のどちらかで対策を比較することで構成されていターゲットごとに、付勢唯一の信号強度と漂白特性）。量子ドットや有機色素（この例ではatto647N、 図4）のいずれかを使用する場合は、我々や他の6,36,37は、MO間の拡散および移行の面で、同等の動作を観察している運動のDES。二つの条件間の拡散値の変動は細胞間の格差（ 図4C）よりも低くなっています。これは、ラベリング価は、さらに厳密に一価されていない場合、大幅にSPTの結果に影響を与えないことを示しています。
閉じ込めと分子間相互作用
一過性または安定閉じ込めが優先的親和性や相互作用24から29までの署名と解釈することができます。生体膜は、疎水性、膜貫通サイズや界面張力などの構造的特徴によって決まる地方議会で、実際に強く不均一である。これらの駆動力は、すなわちシグナル伝達、接着、または人身売買のために重要な役割と機能アセンブリの時空間モデリングにつながる。そのようなイベントをマッピングし、定量化は、セルが連続して提示刺激を統合する方法を解読する鍵を提供することが期待されています。確かに、セルの、正確な応答REQを通して適切な適応を示すuiresは、シグナリングパートナーとその環境間の相互作用を調整する。膜受容体は、サブ膜骨格のフェンスなど、エンドサイトーシスピットや接着斑のような膜構造、または例えば、ドメインのシグナリングに関与する脂質/ proteicパートナー、のいずれかで相互作用する可能性があります。私たちの表現には、このようなイベントは、閉じ込めの強さと空間と時間をかけてそのバリエーションを通して検討することができます。前述したように、これはさらに、心に短いタイミングと高い密度に関連する制約を維持し、達成可能な最高の空間時間分解能での作業の重要性を強化しています。
補完的なテクニック
それは他のアプローチでダイナミックな測定値を比較することをお勧めします。インスタンスの他の動的な顕微鏡技術については、FRAPとFCSのように、相補感度と分解能4,38,39を提供しています 。 FCSは、sに達することができながら、FRAPは、分子拡散のアンサンブル測定を提供しています非常に良い時間分解能を持つ高感度イングル分子、。ただし、両方のメソッドは本質的にローカル尺度（典型的には共焦点スポット以内）に制限されています。広い視野を調査し、局所的に関連する空間的精度と一緒に、一度に全細胞を包含する：これは利用して、SPTの空間の可能性の限界をプッシュすることが動機となっている。
さらに開発·調査
単一分子計測を用いて対処することができる生物学的な質問の範囲に従って、MTTは、各レベルで、様々な方向に沿って拡張することができます：検出、推定、再接続し、その後の更なる分析。たとえば、1つは多色検出のための呼び出しは、複数の分子の集団を扱う検討すること - 専用の光ファイバまたは分析スキームを使用して実行することができますように。推定は、任意のスペクトルや偏光情報、あるいは軸として新しい関連記述子を含めることができます。3D 40にトレースを拡張するためのzの位置。
再接続のために、ブラウン運動と点滅の仮定が完全に特定の問題を再考することができます。興味深いことに、単一分子計測は、いわゆるナノ領域17,22,23に過去10年間にわたって拡張されています。 MTTは、直接単一分子の局在化に取り組んでいますが、それは分子の人口の徹底的なローカライズのための安全なソリューションを提供し、固定サンプルの場合を考慮する非常に重要である。しかし、このような場合には、ブラウン運動の仮定はもはや有効ではありません。正確にのみSNRによって制限ナノ尺度を、処理することによって、それを置き換えて、最高のナノ分解能を達成するための非常に重要です。
このような動きに沿って、多色、3D、および/または網羅的な措置のいずれかに基づいて、今後の作業は、分子の静的および動的なデータの包括的なビューを提供することが期待されている。これは直接relevを持っています。そのような余分なと細胞内シグナル伝達を調節する微妙な様式を解読するように細胞生物学研究のためのインピーダンス。
MTTをダウンロードする
MTTのソースコードは、学術研究用のオープンソースソフトウェアとして利用可能です。それはでは、弊社のWebページからダウンロードすることができますciml.univ-mrs.fr我々のチームのページに移動して、彼＆Marguet Labは、ソフトウェアの説明とダウンロード用のリンクを提供します。我々はさらに協力の場合には、例えば、情報だけのためにお名前と機関を尋ねたり、新しいリリースまたは更新を通知するために注意してください。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
私たちは彼らのサポートと実りある議論のために、我々のチームのメンバーは、技術支援のために特にMC Blacheと同様に、MイルラとB Imhofに感謝します。デフレと閉じ込めの数値は、自然法の礼儀を再現しました。このプロジェクトは、CNRSからの機関の助成金によって、INSERMとマルセイユ大学、地域プロヴァンス=アルプ=コート·d'Azur、研究所国立デュ癌、AFP通信国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR-08-PCVI-から、特定の補助金によってサポートされています0034から02、ANR 2010 BLAN 1214 01）·財団流動ラ·ルシェルシュMédicale（エキップlabéliséeFRM-2009）。 VRはリーグ国立Contre leのがんからのフェローシップでサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
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