Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse
Summary
In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Maus Ischiasnerv zu zerschlagen. Diese Methode verwendet leicht verfügbar Arterienklemmen und einfach und reproduzierbar produziert komplette Ischiasnerv verknallt. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um Muskeln ganzen Halterungen für die Analyse der Nervenregeneration nach Ischiasnerv verknallt vorzubereiten.
Abstract
Regeneration im peripheren Nervensystem (PNS) ist weit verbreitet sowohl für seine Relevanz für die menschliche Krankheit und die robuste regenerative Reaktion von PNS Neuronen damit möglicherweise die Beleuchtung der Ausfälle von ZNS-Regeneration 1 montiert verstehen, intensiv untersucht. Ischiasnerv Crush (Axonotmesis) ist eine der gängigsten Modelle von peripheren Nervenverletzungen bei Nagern 2. Crushing unterbricht alle Axone aber Schwann-Zell Basallaminae bleiben erhalten, so dass eine optimale Regeneration ist 3,4. Dies ermöglicht es dem Prüfer, um genau zu studieren: die Fähigkeit eines wachsenden Axons sowohl mit der Schwann-Zellen und Basallaminae 4 interagieren. Ratten waren im Allgemeinen die bevorzugten Tiermodellen für experimentelle Nervenquetschungs. Sie sind weit verbreitet und ihre lädierten Ischiasnerv bietet eine angemessene Annäherung an die menschliche Nervenläsionen 5,4. Obwohl in der Größe kleiner als Ratte Nerven, die Maus N. viele ähnliche Eigenschaften. Am wichtigsten ist jedoch, mousE-Modelle sind immer wertvoll, weil von der breiten Verfügbarkeit von transgenen Linien erlaubt nun eine detaillierte Analyse der einzelnen Moleküle von entscheidender Bedeutung für die Regeneration von Nerven 6, 7. Vor Ermittler haben mehrere Methoden verwendet, um eine Nervenquetschungs oder Verletzungen, einschließlich einfacher abgewinkelte Pinzetten, Zangen gekühlt, Arterienklemmen, Gefäßklemmen und Forschern entwickelt Klammern 8,9,10,11,12 produzieren. Die Ermittler haben auch verschiedene Methoden zur Markierung der verletzten Stelle mit Naht, Kohlenstoff-Teilchen und fluoreszierende Kügelchen 13,14,1 verwendet. Wir beschreiben unsere Methode, um eine komplette reproduzierbar Ischiasnerv verknallt genaue und anhaltende Kennzeichnung des Crush-Website mit einer feinen Pinzette hämostatischen und anschließender Kohlenstoff Crush-Ort-Kennzeichnung zu erhalten. Als Teil unserer Beschreibung der Ischiasnerv verknallt Verfahren haben wir auch eine relativ einfache Methode des Muskels enthalten ganze montieren wir nutzen, um anschließend zu quantifizieren Regeneration.
Protocol
Discussion
Wir haben eine Methode, um eine komplette zuverlässig Ischiasnerv crush mit genauen Kennzeichnung des Crush-Site zu erhalten präsentiert. Wie bereits erwähnt, ist Ischiasnerv crush ein gemeinsames Modell der peripheren Nervenverletzungen bei Mäusen und Ratten. Obwohl jede Methode der Andrang hat seine Vorteile und Nachteile, fanden wir dieses Verfahren hergestellt werden eine komplette verknallt, die leicht mit einem Minimum an speziellen Geräten (zB spezielle Klemmen, etc.) gekennzeichnet war.
<p class="jove_s…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH K08NS065157 Zuschüsse (bis TAF) Außerdem unterstützt wurde, das Penn Center für Erkrankungen des Bewegungsapparats, Auszeichnung Anzahl P30AR050950 vom National Institute of Arthritis, Muskel-Skelett unterstützt und Hautkrankheiten diese Arbeit (TAF und Steven S. Scherer). Schließlich unterstützt Shriners Pediatric Research Center Seed-Finanzierung (TAF) diese Arbeit. Wir danken Herrn Dr. Young-Jin Sohn für zunächst zeigen, daß der ganze Berg Verfahren und Amy A. Kim für ihre Unterstützung bei der Erstellung der Skizzen von Abbildung 1 zu bestätigen.
Materials
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Mini Clipper with No. 0000 Blade | Roboz | RC-5903 |
| Nair Hair Remover (9 oz.) | Church and Dwight Co., Inc. | N/A |
| Betadine Surgical Scrub (1 gallon) | Fisher Scientific | 19066452 |
| Ophthalmic Ointment (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Surgical Tools:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| FST 250 Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 |
| Iris Scissors (11 cm long) | World Precision Instruments | 500216 |
| Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11024-18 |
| McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) | World Precision Instruments | 14124-G |
| Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) | Fine Science Tools | 13020-12 |
| Powdered Activated Carbon (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) | Roboz | SUT-1073-11 |
| Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) | World Precision Instruments | 500345 |
| 9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) | World Precision Instruments | 500346 |
Animal Care:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| 0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Surgical Platform and Retractors:
(purchased at local hardware store)
| Name (description/) | Quantity |
| Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) | 1 |
| Button Magnets (Example: Eclipse E825) | 3 |
| Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) | 3 |
| Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) | 9 |
| Rubber Bands (Light Tension) | 3 |
| Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) | 3 |
Semi-Thins:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Propylene Oxide (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine Blue (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycine, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) | Fine Science Tools | 26001-40 |
| Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific | Jackson ImmunoResearch | 115-095-205 |
| DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Mounting Medium (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
References
- Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
- Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).
- Amado, S., Simñes, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Luís, A. L., Shirosaki, Y. Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model. Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).
- Luís, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Simðes, M. J. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28, 458-470 (2008).
- Luís, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Simðes, M. J. Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).
- Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse – adaptation of the sciatic static index. J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).
- Ronchi, G., Raimondo, S., Varejão, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. Standardized crush injury of the mouse median nerve. J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).
- Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion. Neuroreport. 21, 782-785 (2010).
- Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve. Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).
- Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse. BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).
- Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve. J. Anat. 206, 69-78 (2005).
- Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp. J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).
