استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات
Summary
نحن في هذا التقرير وصفا لطريقة لسحق العصب الوركي الماوس. هذا الأسلوب يستخدم الملقط مرقئ متاحة بسهولة ويسر، وبتكاثر تنتج كاملة سحق العصب الوركي. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن تصف طريقة لإعداد يتصاعد العضلات كلها مناسبة للتحليل من تجديد العصب بعد سحق العصب الوركي.
Abstract
تدرس على نطاق واسع في تجديد النظام العصبي الطرفي (المحيطي) على حد سواء لأهميتها بالنسبة لمرض الإنسان وفهم ردا قويا على التجدد التي تنفذها الخلايا العصبية الجهاز العصبي المحيطي وبالتالي إلقاء الضوء ربما فشل تجديد الجهاز العصبي المركزي 1. الوركي سحق العصبية (انهتاك المحوار) هو واحد من النماذج الأكثر شيوعا لإصابة الأعصاب الطرفية في القوارض 2. سحق المقاطعات هي الحفاظ على جميع المحاور لكن شوان الصفائح الخلايا القاعدية بحيث التجديد هو الأمثل 3،4. هذا يسمح للمحقق على وجه التحديد لدراسة قدرة محور عصبي متزايد للتفاعل مع كل من خلايا شوان والصفيحة القاعدية 4. وكانت الفئران عموما على نماذج حيوانية المفضل لسحق العصب التجريبية. وهي متاحة على نطاق واسع وأعصابهم الوركي lesioned يوفر تقريب معقول من الآفات العصبية الإنسان 5،4. على الرغم من أصغر في الحجم من العصب الفئران، العصب الماوس لديه صفات كثيرة مماثلة. إلا أن الأهم، مذكرات تفاهمالنماذج الإلكترونية هي ذات قيمة متزايدة بسبب توافر واسعة من خطوط المعدلة وراثيا يسمح الآن لتشريح مفصل للجزيئات الفردية حاسمة لتجديد العصبية 6 و 7. وقد استخدم المحققون قبل أساليب متعددة لإنتاج سحق العصب أو إصابة بما في ذلك ملقط الزاوية بسيط، ملقط المبردة، ملقط مرقئ، والمشابك الأوعية الدموية، والمشابك محقق المصممة 8،9،10،11،12. وقد استخدم الباحثون أيضا أساليب مختلفة لوضع العلامات على موقع الإصابة بما في ذلك خياطة الجروح، وجزيئات الكربون والخرز فلوري 13،14،1. نحن لدينا وصف طريقة للحصول على كامل بتكاثر سحق العصب الوركي مع دقيق ومستمر من وضع علامات للموقع سحق باستخدام ملقط غرامة مرقئ والكربون لاحق سحق الموقع وسم. كجزء من الوصف الذي نعيش فيه من إجراء العصب الوركي سحق ادرجنا أيضا طريقة بسيطة نسبيا من كل عضلة جبل نستخدمها لتحديد وقت لاحق تجديد.
Protocol
Discussion
قدمنا وسيلة للحصول على كامل موثوق سحق العصب الوركي مع الدقيق وسم من موقع التدافع. كما ذكر سابقا، الوركي سحق العصب هو نموذج شائع للإصابة الأعصاب الطرفية في الفئران والجرذان. على الرغم من أن كل طريقة من سحق له مزاياه وعيوبه، وجدنا هذه الطريقة تنتج سحق الكاملة التي ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K08NS065157 (إلى TAF) وبالإضافة إلى ذلك، فإن مركز جامعة بنسلفانيا لاضطرابات العظام والعضلات، جائزة P30AR050950 عدد من المعهد الوطني لالتهاب المفاصل، أمراض العضلات والعظام ودعمت الجلد، وهذا العمل (TAF وستيفن شيرر S.). وفي الختام، أيد Shriners الأطفال البذور مركز تمويل البحوث (TAF) هذا العمل. نود أن نعترف الدكتور يونغ جين الابن لتظاهرهم في البداية كل إجراء جبل ايمي وكيم ألف لتقديم المساعدة لها في انتاج الرسومات من الشكل رقم 1.
Materials
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Mini Clipper with No. 0000 Blade | Roboz | RC-5903 |
| Nair Hair Remover (9 oz.) | Church and Dwight Co., Inc. | N/A |
| Betadine Surgical Scrub (1 gallon) | Fisher Scientific | 19066452 |
| Ophthalmic Ointment (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Surgical Tools:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| FST 250 Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 |
| Iris Scissors (11 cm long) | World Precision Instruments | 500216 |
| Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11024-18 |
| McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) | World Precision Instruments | 14124-G |
| Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) | Fine Science Tools | 13020-12 |
| Powdered Activated Carbon (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) | Roboz | SUT-1073-11 |
| Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) | World Precision Instruments | 500345 |
| 9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) | World Precision Instruments | 500346 |
Animal Care:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| 0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Surgical Platform and Retractors:
(purchased at local hardware store)
| Name (description/) | Quantity |
| Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) | 1 |
| Button Magnets (Example: Eclipse E825) | 3 |
| Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) | 3 |
| Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) | 9 |
| Rubber Bands (Light Tension) | 3 |
| Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) | 3 |
Semi-Thins:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Propylene Oxide (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine Blue (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycine, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) | Fine Science Tools | 26001-40 |
| Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific | Jackson ImmunoResearch | 115-095-205 |
| DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Mounting Medium (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
References
- Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
- Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).
- Amado, S., Simñes, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Luís, A. L., Shirosaki, Y. Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model. Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).
- Luís, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Simðes, M. J. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28, 458-470 (2008).
- Luís, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Simðes, M. J. Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).
- Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse – adaptation of the sciatic static index. J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).
- Ronchi, G., Raimondo, S., Varejão, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. Standardized crush injury of the mouse median nerve. J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).
- Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion. Neuroreport. 21, 782-785 (2010).
- Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve. Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).
- Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse. BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).
- Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve. J. Anat. 206, 69-78 (2005).
- Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp. J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).
