Summary

Reproduceerbare Mouse heupzenuw Crush en de daaropvolgende beoordeling van Regeneratie door Whole Mount Muscle Analyse

Published: February 22, 2012
doi:

Summary

In dit rapport beschrijven we een methode om de muis heupzenuw te verpletteren. Deze methode maakt gebruik van direct beschikbaar hemostatische tang en gemakkelijk en reproduceerbaar maakt complete heupzenuw crush. Daarnaast beschrijven we een methode om de spieren hele mounts geschikt voor analyse van de zenuw regeneratie na heupzenuw verliefd te bereiden.

Abstract

Regeneratie van het perifere zenuwstelsel (PNS) wordt op grote schaal onderzocht, zowel voor de relevantie ervan voor de menselijke ziekte en de robuuste regeneratieve respons gemonteerd door PNS neuronen daarmee mogelijk het verlichten van de mislukkingen van CNS regeneratie 1 te begrijpen. Heupzenuw Crush (axonotmesis) is een van de meest voorkomende modellen van perifere zenuwschade bij knaagdieren 2. Breken onderbreekt alle axonen, maar Schwann cel basale laminae worden bewaard, zodat de regeneratie optimaal is 3,4. Hierdoor kan de onderzoeker nauwkeurig onderzoek het vermogen van een toenemende axon interactie met zowel de Schwann cel basale lamellen 4. Ratten zijn over het algemeen de voorkeur diermodellen voor experimentele zenuw crush. Ze zijn op grote schaal beschikbaar en hun gelaedeerde heupzenuw biedt een redelijke benadering van de menselijke zenuwletsels 5,4. Hoewel kleiner in omvang dan de rat zenuw, de muis zenuw heeft vele gelijkaardige kwaliteiten. Het belangrijkste is echter, mouse modellen zijn steeds waardevoller vanwege de ruime beschikbaarheid van transgene lijnen maakt het nu mogelijk voor een gedetailleerde dissectie van de individuele moleculen van cruciaal belang voor zenuwregeneratie 6, 7. Voorafgaand onderzoekers gebruik hebben gemaakt van verschillende methoden om een zenuw drukken of letsel, met inbegrip eenvoudige schuine pincet, gekoeld tang, hemostatische tang, vasculaire klemmen en onderzoeker ontworpen klemmen 8,9,10,11,12 te produceren. Onderzoekers hebben ook gebruik gemaakt van verschillende methoden voor het markeren van de schade site met inbegrip van hechtdraad, carbon deeltjes en fluorescerende kralen 13,14,1. We beschrijven onze methode om een ​​reproduceerbaar volledige heupzenuw verliefd te verkrijgen met nauwkeurige en blijvende markering van de crush-site met behulp van een fijne hemostatische tang en de daaropvolgende koolstof crush-locatie markering. Als onderdeel van onze beschrijving van de nervus ischiadicus verliefd procedure die wij hebben ook een relatief eenvoudige methode om de spieren geheel te monteren die we gebruiken om vervolgens te kwantificeren regeneratie.

Protocol

1. Animal Onderwerpen 1.1. Behandeling Alle dierlijke procedures dienen te worden uitgevoerd met toestemming van Animal van de lokale instelling Zorg en ethische commissie en in overeenstemming met het gebruik en het Comite en de National Institutes of Health richtlijnen, met maatregelen die zijn genomen om pijn en ongemak te minimaliseren. Onze muizen werden gehuisvest in een temperatuur-gecontroleerde omstandigheden op een 12-uurs omgekeerde licht en donker cyclus, terwij…

Discussion

Wij hebben voorgesteld een methode om een ​​betrouwbaar volledige heupzenuw verliefd te verkrijgen met precieze aanduiding van de crush site. Zoals eerder vermeld, heupzenuw verliefdheid is een gemeenschappelijke model voor de perifere zenuwschade bij muizen en ratten. Hoewel elke methode van verliefdheid heeft zijn voor-en nadelen, vonden we deze methode leverde een compleet verliefd die gemakkelijk werd gemarkeerd met een minimum van speciale apparatuur (bv. speciale klemmen, etc).

Crush …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de NIH subsidies K08NS065157 (tot TAF) Daarnaast is de Penn Centrum voor spier-en skeletaandoeningen, Award nummer P30AR050950 van het Nationaal Instituut van artritis, spier-en huidziekten deze werkzaamheden ondersteund (TAF en Steven S. Scherer). Tot slot, Shriners Pediatric Research Center Seed financiering (TAF) deze werkzaamheden ondersteund. We willen Dr Young-Jin Zoon erkennen voor in eerste instantie het aantonen van de ganse berg procedure en Amy A. Kim voor haar hulp bij het produceren van de schetsen van figuur 1.

Materials

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Mini Clipper with No. 0000 Blade Roboz RC-5903
Nair Hair Remover (9 oz.) Church and Dwight Co., Inc. N/A
Betadine Surgical Scrub (1 gallon) Fisher Scientific 19066452
Ophthalmic Ointment (1 oz.) Fisher Scientific 19082795

Surgical Tools:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
FST 250 Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Iris Scissors (11 cm long) World Precision Instruments 500216
Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) Fine Science Tools 11024-18
McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) World Precision Instruments 14124-G
Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11252-30
Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11251-35
Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) Fine Science Tools 13020-12
Powdered Activated Carbon (500 g) Fisher Scientific C272-500
Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) Roboz SUT-1073-11
Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) World Precision Instruments 500345
9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) World Precision Instruments 500346

Animal Care:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) Hospira 0409-4888-20
Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) Harvard Apparatus 507222F

Surgical Platform and Retractors:

(purchased at local hardware store)

Name (description/) Quantity
Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) 1
Button Magnets (Example: Eclipse E825) 3
Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) 3
Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) 9
Rubber Bands (Light Tension) 3
Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) 3

Semi-Thins:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18431
Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18465
Propylene Oxide (450 mL) Ted Pella, Inc. 18601
Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) Electron Microscopy Sciences 14120
Toluidine Blue (25 g) Ted Pella, Inc. 19451

Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL)

Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. 50-61-00
Triton X-100 (100 mL) Dot Scientific Incorporated 9002-93-1
Glycine, 98% (1 kg) Fisher Scientific AC12007-0010
Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) Fisher Scientific 14-373-65
Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) Fisher Scientific NC9492579
Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) Fine Science Tools 26001-40
Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) Sigma-Aldrich T0195-.5MG
Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) Covance SMI-312R
Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) SV2
Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 Novus Biologicals NB300-143
Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific Jackson ImmunoResearch 115-095-205
DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-495-152
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) Invitrogen D3571
Vectashield Mounting Medium (10 mL) Vector Laboratories H-1000
Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) Fisher Scientific 12-548-5C

References

  1. Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
  2. Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).
  3. Amado, S., Simñes, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Luís, A. L., Shirosaki, Y. Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model. Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).
  4. Luís, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Simðes, M. J. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28, 458-470 (2008).
  5. Luís, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Simðes, M. J. Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).
  6. Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse – adaptation of the sciatic static index. J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).
  7. Ronchi, G., Raimondo, S., Varejão, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. Standardized crush injury of the mouse median nerve. J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).
  8. Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion. Neuroreport. 21, 782-785 (2010).
  9. Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve. Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).
  10. Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse. BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).
  11. Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve. J. Anat. 206, 69-78 (2005).
  12. Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp. J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).

Play Video

Cite This Article
Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis. J. Vis. Exp. (60), e3606, doi:10.3791/3606 (2012).

View Video