Summary

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Published: February 22, 2012
doi:

Summary

本報告では、マウス坐骨神経を粉砕する方法を説明します。このメソッドは、容易に利用可能な止血鉗子を使用して、簡単かつ再現性を完全に坐骨神経のときめきを生成します。さらに、坐骨神経挫滅後の神経再生の解析に適した筋肉全体のマウントを準備する方法について説明します。

Abstract

末梢神経系(PNS)の再生が広く、両方のヒトの疾患との関連性について検討されており、それによっておそらくCNS再生1の障害を照らすPNSニューロンによってマウントされた堅牢な回生応答を理解する。坐骨神経のときめき(軸索断裂)は、げっ歯類の2の末梢神経損傷の最も一般的なモデルの一つです。その再生が3,4に最適ですので、破砕の割り込みはすべての軸索がシュワン細胞基底層は保持されます。これは研究者が正確にシュワン細胞と基底層4の両方と相互作用する軸索成長の能力を研究することができます。ラットは、一般的に実験的な神経の粉砕のための好ましい動物モデルをされている。彼らは広く入手可能であり、その病変坐骨神経は、ヒトの神経病変5,4の合理的な近似値を提供しています。ラットの神経よりもサイズが小さくても、マウスの神経は、多くの類似した性質を持​​っています。最も重要なのはしかし、覚書Eモデルがあるためトランスジェニック系統の幅広い可用性、ますます貴重なものになりまし神経再生6、7の重要な個々の分子の詳細な解剖を可能にします。前の調査官は、単純な直角鉗子、チルド鉗子、止血鉗子、血管クランプ、および治験責任医師に設計されたクランプ8,9,10,11,12含む神経クラッシュやけがを生成するために複数のメソッドを使用しています。捜査官はまた、縫合糸、炭素粒子と蛍光ビーズ13,14,1含む損傷部位のマーキングの様々な方法を使用しています。我々は、クラッシュサイトのマーキングを正確かつ永続的な細かい止血鉗子とそれに続く炭素ときめきサイトマーキングを使用して再現性を完全に坐骨神経のときめきを得るための手法を説明します。坐骨神経挫滅手順の我々の記述の一部として、我々はまた我々はその後再生を定量化するために使用するマウント筋肉全体の比較的単純な方法が含まれている。

Protocol

1。動物の科目 1.1。治療すべての動物の手順は、痛みや不快感を最小限に抑えるためにとられた措置で、地元の金融機関の動物のケアと倫理委員会の承認を得て衛生ガイドラインの使用と委員会と国立研究所に従って実行する必要があります。 私たちのマウスは、給餌マウス飼料および水を自由に摂取しながら、12時間逆明暗サイクルで温度制御された条件?…

Discussion

我々は、クラッシュサイトの正確なマーキングを確実に完全に坐骨神経のときめきを取得する方法を提案した。前述のように、坐骨神経のときめきは、マウスとラットの末梢神経損傷の一般的なモデルです。ときめきの各メソッドは、その長所と短所がありますが、我々は、このメソッドは、簡単に特殊な装置(例えば特殊なクランプ、等)の最小値でマークされた完全なクラッシュを作り?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、関節リウマチの国立研究所からの筋骨格系疾患のためのペンセンター、賞の数P30AR050950さらに、NIHの助成金K08NS065157(TAFまで)によってサポートされていました、筋骨格系と皮膚疾患は、(TAFとSteven S.シェーラー)この作業をサポートしていました。最後に、シュライナーズ小児研究センターのシード資金(TAF)は、この作業をサポートしていました。私たちは、最初に図1のスケッチを製造する彼女の援助全体のマウント手順とエイミーA.キムを示すために博士·ヨンジンの息子に感謝します。

Materials

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Mini Clipper with No. 0000 Blade Roboz RC-5903
Nair Hair Remover (9 oz.) Church and Dwight Co., Inc. N/A
Betadine Surgical Scrub (1 gallon) Fisher Scientific 19066452
Ophthalmic Ointment (1 oz.) Fisher Scientific 19082795

Surgical Tools:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
FST 250 Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Iris Scissors (11 cm long) World Precision Instruments 500216
Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) Fine Science Tools 11024-18
McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) World Precision Instruments 14124-G
Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11252-30
Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11251-35
Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) Fine Science Tools 13020-12
Powdered Activated Carbon (500 g) Fisher Scientific C272-500
Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) Roboz SUT-1073-11
Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) World Precision Instruments 500345
9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) World Precision Instruments 500346

Animal Care:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) Hospira 0409-4888-20
Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) Harvard Apparatus 507222F

Surgical Platform and Retractors:

(purchased at local hardware store)

Name (description/) Quantity
Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) 1
Button Magnets (Example: Eclipse E825) 3
Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) 3
Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) 9
Rubber Bands (Light Tension) 3
Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) 3

Semi-Thins:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18431
Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18465
Propylene Oxide (450 mL) Ted Pella, Inc. 18601
Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) Electron Microscopy Sciences 14120
Toluidine Blue (25 g) Ted Pella, Inc. 19451

Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL)

Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. 50-61-00
Triton X-100 (100 mL) Dot Scientific Incorporated 9002-93-1
Glycine, 98% (1 kg) Fisher Scientific AC12007-0010
Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) Fisher Scientific 14-373-65
Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) Fisher Scientific NC9492579
Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) Fine Science Tools 26001-40
Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) Sigma-Aldrich T0195-.5MG
Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) Covance SMI-312R
Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) SV2
Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 Novus Biologicals NB300-143
Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific Jackson ImmunoResearch 115-095-205
DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-495-152
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) Invitrogen D3571
Vectashield Mounting Medium (10 mL) Vector Laboratories H-1000
Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) Fisher Scientific 12-548-5C

References

  1. Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
  2. Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).
  3. Amado, S., Simñes, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Luís, A. L., Shirosaki, Y. Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model. Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).
  4. Luís, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Simðes, M. J. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28, 458-470 (2008).
  5. Luís, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Simðes, M. J. Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).
  6. Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse – adaptation of the sciatic static index. J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).
  7. Ronchi, G., Raimondo, S., Varejão, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. Standardized crush injury of the mouse median nerve. J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).
  8. Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion. Neuroreport. 21, 782-785 (2010).
  9. Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve. Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).
  10. Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse. BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).
  11. Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve. J. Anat. 206, 69-78 (2005).
  12. Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp. J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).

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Cite This Article
Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis. J. Vis. Exp. (60), e3606, doi:10.3791/3606 (2012).

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