Summary

Воспроизводимые мыши седалищного нерва и Давка Последующие оценки регенерации полного анализа горы мышц

Published: February 22, 2012
doi:

Summary

В этом докладе мы описываем способ раздавить мышь седалищного нерва. Этот метод использует доступны гемостаза щипцы и легко воспроизводимым и производит полный седалищный нерв давка. Кроме того, мы опишем способ подготовить мышцы все крепления подходят для анализа регенерации нерва после седалищный нерв давка.

Abstract

Регенерация в периферической нервной системы (ПНС) широко изучается как для его отношение к болезни человека и понять, надежная регенеративный ответ монтируется нейронов ПНС что, возможно, освещение неудач ЦНС регенерации 1. Седалищный нерв давке (axonotmesis) является одним из наиболее распространенных моделей повреждения периферического нерва у грызунов 2. Дробление прерывания все аксоны, но Шванн клетки базальной пластинки сохраняются, так что восстановление оптимального 3,4. Это позволяет исследователю изучать именно способность растущих аксонов взаимодействовать как с клетки Шванн и базальной пластинки 4. Крысы в ​​целом были предпочтительным животных моделей для экспериментальных давке нерва. Они широко доступны и их пораженном седалищного нерва дает разумное приближение человека поражения нерва 5,4. Несмотря на меньший размер, чем нерва крысы, мыши нерв имеет много схожих качеств. Самое главное, хотя, меморандумы о взаимопониманииэлектронной модели становятся все более ценными из-за широкой доступности трансгенных линий теперь позволяет для детального расчленения отдельных молекул важны для регенерации нерва 6, 7. До исследователи использовали несколько методов для получения давке нерва или травмы, включая простой угловой пинцет, охлажденные щипцы, пинцеты гемостаза, сосудистые зажимы, и следователь-зажимы предназначены 8,9,10,11,12. Исследователи также использовали различные методы маркировки в месте повреждения, включая шовный материал, частицы углерода и люминесцентные бусины 13,14,1. Мы описываем наш метод получения полного воспроизводимо седалищного нерва с поклонников точных и постоянных маркировки краш-сайт с помощью тонкой гемостаза щипцы и последующих углерода краш-сайт маркировки. В рамках нашего описания седалищного нерва процедура давки мы также включили относительно простой метод мышечного все смонтировать мы используем, чтобы в дальнейшем количественно регенерации.

Protocol

1. Животное субъектов 1.1. Лечение Все животные процедуры должны выполняться с одобрения местных животных Учреждения по уходу и Комитет по этике и в соответствии с использованием и Комитета и Национального института здоровья принципы, меры, принимаемые для минимизац…

Discussion

Мы представили метод получения полного надежно седалищный нерв давка с точной маркировки давке сайта. Как упоминалось ранее, седалищный нерв давка общую модель повреждения периферического нерва у мышей и крыс. Хотя каждый метод имеет давка свои преимущества и недостатки, мы нашли это?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами NIH K08NS065157 (для TAF) Кроме того, Пенн центра опорно-двигательного аппарата, премии Количество P30AR050950 из Национального института артрита, костно-мышечной и кожных заболеваний поддержала эту работу (TAF и Стивен С. Шерер). Наконец, Shriners Детская научно-исследовательский центр Начальное финансирование (TAF) поддержал эту работу. Мы хотели бы поблагодарить д-р Ен Джина Сына сначала демонстрируют все горе процедуры и Эми А. Кима за помощь в создании эскизов на рисунке 1.

Materials

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Mini Clipper with No. 0000 Blade Roboz RC-5903
Nair Hair Remover (9 oz.) Church and Dwight Co., Inc. N/A
Betadine Surgical Scrub (1 gallon) Fisher Scientific 19066452
Ophthalmic Ointment (1 oz.) Fisher Scientific 19082795

Surgical Tools:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
FST 250 Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Iris Scissors (11 cm long) World Precision Instruments 500216
Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) Fine Science Tools 11024-18
McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) World Precision Instruments 14124-G
Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11252-30
Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11251-35
Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) Fine Science Tools 13020-12
Powdered Activated Carbon (500 g) Fisher Scientific C272-500
Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) Roboz SUT-1073-11
Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) World Precision Instruments 500345
9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) World Precision Instruments 500346

Animal Care:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) Hospira 0409-4888-20
Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) Harvard Apparatus 507222F

Surgical Platform and Retractors:

(purchased at local hardware store)

Name (description/) Quantity
Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) 1
Button Magnets (Example: Eclipse E825) 3
Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) 3
Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) 9
Rubber Bands (Light Tension) 3
Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) 3

Semi-Thins:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18431
Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18465
Propylene Oxide (450 mL) Ted Pella, Inc. 18601
Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) Electron Microscopy Sciences 14120
Toluidine Blue (25 g) Ted Pella, Inc. 19451

Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL)

Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. 50-61-00
Triton X-100 (100 mL) Dot Scientific Incorporated 9002-93-1
Glycine, 98% (1 kg) Fisher Scientific AC12007-0010
Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) Fisher Scientific 14-373-65
Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) Fisher Scientific NC9492579
Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) Fine Science Tools 26001-40
Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) Sigma-Aldrich T0195-.5MG
Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) Covance SMI-312R
Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) SV2
Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 Novus Biologicals NB300-143
Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific Jackson ImmunoResearch 115-095-205
DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-495-152
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) Invitrogen D3571
Vectashield Mounting Medium (10 mL) Vector Laboratories H-1000
Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) Fisher Scientific 12-548-5C

References

  1. Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
  2. Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).
  3. Amado, S., Simñes, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Luís, A. L., Shirosaki, Y. Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model. Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).
  4. Luís, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Simðes, M. J. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28, 458-470 (2008).
  5. Luís, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Simðes, M. J. Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).
  6. Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse – adaptation of the sciatic static index. J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).
  7. Ronchi, G., Raimondo, S., Varejão, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. Standardized crush injury of the mouse median nerve. J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).
  8. Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion. Neuroreport. 21, 782-785 (2010).
  9. Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve. Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).
  10. Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse. BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).
  11. Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve. J. Anat. 206, 69-78 (2005).
  12. Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp. J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).

Play Video

Cite This Article
Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis. J. Vis. Exp. (60), e3606, doi:10.3791/3606 (2012).

View Video