Summary
हम तिल्ली के intravital माइक्रोस्कोपी GFP ट्रांसजेनिक मलेरिया परजीवी और इस अंग के भीतर परजीवी गतिशीलता और रक्त प्रवाह की मात्रा का ठहराव का उपयोग प्रदर्शन के लिए विधि दिखा.
Protocol
इस विधि 7 में रिपोर्ट अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया था.
1. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) ट्रांसजेनिक परजीवी के साथ पशु संक्रमण
- पी. yoelii - GFP 17XL और 17X के ट्रांसजेनिक लाइनों एक ही वैक्टर उत्पन्न का उपयोग कर रहे थे, रणनीति लक्ष्यीकरण और प्रोटोकॉल पी. के लिए कहीं वर्णित 8 berghei. वे पी. के सर्वव्यापी प्रमोटर के तहत 9 GFP के उत्परिवर्ती संस्करण 3 व्यक्त berghei बढ़ाव एक कारक (Pbeef1a) है, जो GFP के विधान अभिव्यक्ति का निर्देशन पूरे अंतर एरिथ्रोसाइटिक विकास चक्र के दौरान cytosol परजीवी.
- Parasitized पी. की लाल रक्त कोशिकाओं (pRBCs) के साथ पशुओं intraperitoneally इंजेक्षन yoelii GFP ट्रांसजेनिक 17XL और 17X लाइनों 5-10% पेरासाइटिमिया पर दाता चूहों की पूंछ रक्त से प्राप्त और पीबीएस में पतला. 5x10 5 pRBCs / माउस की एक खुराक का उपयोग करने के लिए 3 दिन के बाद infecti में 1% की एक परिधीय पेरासाइटिमिया तक पहुँचने(अनुकरणीय).
- दिन 3 अनुकरणीय कि दोनों परजीवी लाइनों के साथ संक्रमित चूहों के पेरासाइटिमिया की जांच Giemsa और एक 100x तेल उद्देश्य के साथ एक प्रकाश खुर्दबीन के तहत धुंधला अवलोकन द्वारा पीछा पूंछ रक्त की एक बूंद के साथ एक रक्त धब्बा कर रही द्वारा एक ही है. पेरासाइटिमिया कुल लाल रक्त कोशिकाओं पर लगभग 300 लाल रक्त कोशिकाओं के तीन क्षेत्रों में ऑप्टिकल pRBCs के प्रतिशत की गणना के द्वारा अनुमान है.
- नियंत्रण FITC लेबल लाल रक्त कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन पशुओं सामान्य spleens में इन कोशिकाओं के आंदोलन विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. FITC और इंजेक्शन के लिए पशुओं को नियंत्रित के साथ लाल रक्त कोशिकाओं के लेबल
- एक माउस / Balb ग के हृदय पंचर के माध्यम से 200 के μl में कुल रक्त का 1 मिलीलीटर लीजिए पीबीएस युक्त ethylene tetraacetic एसिड (EDTA) (100 छ / एल, पीएच 7.4) diamine और धोने में आरबीसी गोली पीबीएस / EDTA (0.1 छ / एल, 7.4 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) 300 (मिनट) XG पर centrifugation के माध्यम से) पीएच.
- 300 और आरबीसी गोली के 200 μl Resuspendम्यू, पीबीएस / EDTA (0.1 छ / एल, पीएच 8) FITC (10 जी / एल) युक्त और कोमल आंदोलन के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते मैं. उस समय के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया है और कोशिकाओं पीबीएस / EDTA (0.1 छ / एल, 7.4 पीएच) (300 XG, 5 मिनट, आरटी) में पांच बार धोए.
- Vivo प्रयोगों में के लिए, FITC लेबल पीबीएस के 200 μl में आरबीसी गोली के 10 μl पतला और एक माउस / Balb ग के लिए नसों इंजेक्षन क्रम में संचलन में 1% FITC - लाल रक्त कोशिकाओं तक पहुँचने.
3. सर्जिकल प्रक्रियाओं
- इंजेक्शन संवेदनाहारी 100 मिलीग्राम / Ketamine किलो और 5 मिलीग्राम / किग्रा Midazolam प्रति खुराक के जानवर के वजन के अनुसार रचना तैयार करें. चतनाशून्य करनेवाली औषधि की एक खुराक के साथ माउस intraperitoneally इंजेक्षन. खुराक का आधा हर 30 मिनट पूर्णकालिक माउस anesthetized बनाए रखने Readminister.
- रखें माउस गर्म और सत्यापित करें कि माउस पूरी तरह से आगे बढ़ने से पहले पैर पैड pinching द्वारा anesthetized (आमतौर पर 5-20 मिनट के बाद) है.
- ताकिप्रयोग के दौरान पदार्थों की नसों में प्रशासन की सुविधा के लिए, एक 27G प्रवेशनी का उपयोग कर माउस के पूंछ नस cannulate. जाँच करें कि सुई में अच्छी तरह से खारा बफर के 20-50 μl इंजेक्शन द्वारा नस के अंदर तैनात है और यह टेप के साथ सील. यदि यह नुकसान पहुँचा है, केन्युलेशन अपस्ट्रीम दोहराने नस. हवाई बुलबुले का परिचय नहीं सावधान रहो.
- त्वचा और जानवर की बाईं पृष्ठीय पक्ष में मांसलता में एक छोटा सा चीरा के माध्यम से तिल्ली के अवर हिस्सा बेनकाब. तिल्ली जहां कम सांस आंदोलन मनाया जाता है प्लेस और रखने के लिए यह माउस बाल और हाइड्रेटेड साफ उजागर सतह पर पीबीएस लागू.
- Cyanoacrylate चिपकने के साथ 60x24mm के कवर पर्ची तिल्ली आसपास के दृश्य की अनुमति त्वचा के लिए (सुपर लॉकटाइट गोंद 3) सील.
4. परजीवी के रहने वाले तिल्ली में इमेजिंग
- Intravital माइक्रोस्कोपी प्रयोगों बाहर एक Leica टीसीएस SP5 confocal खुर्दबीन (Leica में किए गएमाइक्रोसिस्टम्स, हीडलबर्ग, जर्मनी) तापमान नियंत्रण प्रणाली के साथ एक ऊष्मायन, APO 63x ग्लिसरॉल विसर्जन उद्देश्य लेंस (1.3 एनए), 8000 लाइनों / s और एक (488 एनएम) आर्गन और HeNe (594 एनएम, 633 एनएम पर गुंजयमान स्कैनर के साथ सुसज्जित) पराबैंगनीकिरण. नीले डायोड (405 एनएम) और डायोड पंप ठोस राज्य (561 एनएम) जैसे अतिरिक्त लेज़रों, तालिका 1 में सूचीबद्ध जांच की उत्तेजना के लिए आवश्यक हो सकता है.
- माइक्रोस्कोप के मंच पर कवर फिसल तिल्ली उद्देश्य के लिए नीचे का सामना करना पड़ के साथ पशु रखें. तिल्ली के microcirculatory संरचना का एक सामान्य दृश्य वैकल्पिक एक 20x उद्देश्य का उपयोग कल्पना कर सकते हैं. आरबीसी प्रतिबिंब विपरीत उच्च बाद में बढ़ाई छवि के लिए ब्याज की विभिन्न क्षेत्रों का चयन सहायक हो जाएगा.
- 63x ग्लिसरॉल विसर्जन उद्देश्य ऊतक autofluorescence का उपयोग लेंस के साथ ब्याज के चयनित क्षेत्रों में ध्यान दें. GFP परजीवी तिल्ली के विभिन्न क्षेत्रों के माध्यम से पारित करने के लिए मनाया जाता है.
- प्रतिदीप्ति दो अलग चा पर दर्ज की गई हैnnels (FITC / GFP और ऊतक autofluorescence लिए 488/570-630 एनएम के लिए तरंग दैर्ध्य / उत्तेजना उत्सर्जन 488/505-580 एनएम) के pinhole 3.0 हवादार इकाइयों के लिए सेट के साथ. आरबीसी (488/480-495 एनएम) प्रतिबिंब, फ्लोरोसेंट करने के लिए रक्त vasculature लेबल (देखें तालिका 1) रंगों के साथ साथ, imaged और रक्त प्रवाह नीचे वर्णित प्रयोगों में किया जा रहा क्षेत्र पर अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है.
- से पाँच छवियों पर कब्जा अंग के तीन dimensionality की वजह से 8 सुक्ष्ममापी की गहराई को कवर 8 kHz के एक गति से Z-ढेर, 1.5 मिनट के वीडियो उत्पन्न करने के लिए.
- मात्रात्मक विश्लेषण के लिए तिल्ली के विभिन्न क्षेत्रों के रिकॉर्ड वीडियो.
5. तिल्ली और रक्त प्रवाह की माप के लिए छवि अधिग्रहण के microvasculature के intravital माइक्रोस्कोपी
- महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट isotonic खारा में भंग जांच छवि तिल्ली की संरचना में प्रयोग vasculature और लाभ अंतर्दृष्टि के दौरान पूंछ नस में इंजेक्शन जा सकता है. एक सूचीजांच और उनके आवेदन की तालिका 1 10 में प्रस्तुत किया है .
- फ्लोरोसेंट dextran साथ नाड़ी तंत्र लेबल, 70 केडीए dextran खारा बफर के 100 μl में टेक्सास रेड के साथ लेबल के 1 मिलीग्राम तैयार.
- Cannulated पूंछ नस का प्रयोग किया जा रहा imaged जानवर फ्लोरोसेंट dextran इंजेक्षन.
- वाहिकाओं क्षैतिज ऑप्टिकल क्षेत्र रोटेशन (प्रभावित गति नहीं) के द्वारा लेजर स्कैनिंग की दिशा में, सेट. Xy और xt लाइन का प्रयोग करें पोत के केंद्रीय लुमेन में स्कैनिंग मोड. 32 के एक लाइन के औसत के साथ 8 kHz के एक गति से द्विदिश स्कैनिंग 512x512 पिक्सल के एक छवि प्राप्त करने का उपयोग करें.
- तीन अलग अलग चैनलों (तरंगदैर्ध्य उत्तेजना / उत्सर्जन 488/505-580 एनएम, 594/605-660 एनएम / FITC GFP, dextran टेक्सास लाल और एरिथ्रोसाइट प्रतिबिंब, क्रमशः के लिए 488/480-495 एनएम) पर जहाजों की छवियों का मोल.
- अलग diameters और हृदय चक्र के विभिन्न चरणों के साथ जहाजों की छवियों को ले लो उतार - चढ़ाव के लिए क्षतिपूर्ति. इन छवियों में, चलती कोशिकाओं से परिणामस्वरूप धारियाँ के लिए रक्त प्रवाह 11 यों इस्तेमाल किया जाएगा.
6. छवि प्रसंस्करण और परजीवी गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग
- छवि ImageJ सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.39o, Wayne Rasband, एनआईएच, का उपयोग करने के लिए उत्पन्न अनुक्रम से एक वास्तविक समय वीडियो बनाएँ www.macbiophotonics.ca).
- ImageJ lif "में" फ़ाइल "xyzct" अनुक्रम और अलग चैनलों रखने खोलें.
- DblvoxelX - voxel चौड़ाई, dblvoxelY voxel - ऊंचाई, dblvoxelZ - voxel गहराई से और लगातार जेड - फ्रेम के बीच और ढेर के बीच फ्रेम अंतराल: मेटाडेटा फ़ाइल से कुछ उपयोगी जानकारी रजिस्टर. यह जानकारी अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- घटाएँ GFP - परजीवी (चैनल 1) छवियों के लिए autofluorescence (2 चैनल). गाऊसी धब्बा = 1 के साथ छवियों को फ़िल्टर करें. कृपया याद है कि छवियों में गाऊसी धब्बा फिल्टर का उपयोग publicatio के लिए घोषित की जरूरत हैएनएस. सहेजें "animal1_m1_substract.seq" फ़ाइल.
- एक रंग जेड कोडित वीडियो परजीवी गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सहायक सामग्री के रूप में बनाया जाता है, के रूप में यह तेजी से बढ़ कणों और लक्षण वर्णन Z आंदोलन में एकल कण पहचान की सुविधा होगी.
- छवि 5D तीसरा आयाम Z और चौथी बार किया जा रहा है आयाम के साथ किया जा रहा ढेर, में कनवर्ट करना. जेड और उपरिशायी प्रत्येक एक अलग रंग दे.
- परियोजना के सभी जेड सभी समय तख्ते पर अधिकतम तीव्रता का उपयोग करने के लिए एक रंग जेड कोडित वीडियो बनाने. "Animal1_m1_Z_color.avi" के रूप में सहेजें.
- वर्गीकृत और लेबल सभी कणों कि निवास के तख्ते की संख्या (1 से 10 तक) के अनुसार पहले 10 वीडियो के समय फ्रेम में दिखाई देते हैं. प्रत्येक वीडियो में, 20 कणों को प्राप्त अनुपात का पालन नज़र रखी जाएगी. कुल में, 120 परजीवी 3 जानवरों से मात्रा निर्धारित किया जाएगा, छह वीडियो / पशु तिल्ली के विभिन्न क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने का उपयोग.
- प्रत्येक जेड पर निवास के फ्रेम रिपोर्टऔर मात्रा निर्धारित किया जा कणों के लिए पूरी फिल्म पर.
- (एक्स, वाई, जेड, टी) MTrackJ प्लगइन (ई. Meijering द्वारा लिखित) का उपयोग कर कणों के मैनुअल ट्रैकिंग 4D प्रदर्शन. फ़ाइल छवि 5D के रूप में "animal1_m1_substract.seq" खोलें और छवि पिक्सेल चौड़ाई, ऊंचाई, गहराई (सुक्ष्ममापी में) और ढेर अंतराल (सेकंड में) से पहले पंजीकृत जानकारी का उपयोग गुण सेट. ट्रैक के रूप में सेटिंग्स कॉन्फ़िगर: "अगली बार के लिए ले जाने के" और "स्थानीय कर्सर उज्ज्वल centroid/25x25pixel लागू". प्रदर्शित कॉन्फ़िगर: "मूल शो", "शो" छवि, "दिखाने सक्रिय ट्रैक",, "केवल मौजूदा चैनल में मौजूद पटरियों शो" "केवल दिखाने के बिंदु को वर्तमान समय में ट्रैक".
- प्रत्येक कण के लिए एक ट्रैक जोड़ें. Z-अक्ष में आंदोलन सिर्फ अगर विस्थापन 6 सुक्ष्ममापी (एक pRBC के लिए औसत व्यास) की तुलना में अधिक है पर विचार करें. 100 फ्रेम के एक अधिकतम पर कण का पालन करें.
- एक्स, वाई, जेड और निर्देशांक "animal1_m1_p1" के रूप में ट्रैक से मापा. Xls सहेजें.
- विस्थापन के लिए उपाय (डी SQRT = ((x अंतिम-X inital) + (y inital अंतिम y) + 2 (z inital अंतिम z) 2) 2, पथ लंबाई (पी = Σ n = → अंतिम SQRT (0 (x n 1 x n) + 2 ( y के n 1 y-n 2) + (z n 1 z n) n प्रत्येक स्थिति ट्रैक किए गए संकेत के साथ) 2, मतलब वेग और निवास समय से एक्स, वाई, मानों का उपयोग कर परिकलित किया जा सकता z टी, ट्रैक किए गए कैलिब्रेटेड निर्देशांक पंजीकृत डेटा के अनुसार कणों की दिशात्मकता. विस्थापन बनाम पथ लंबाई के भागफल के रूप में परिभाषित किया गया है, एक संकेत आंदोलन निर्देशित और 0 संकेत रोका आंदोलन 12 के करीब के मूल्यों के करीब के मूल्यों के साथ गणना के लिए एक टेम्पलेट संलग्न मदद की है.
7. बड़ा रक्त प्रवाह की गणना
- बड़ा रक्त प्रवाह क्यू = वी * π * डी 2 / 4 v, वी के साथ, एरिथ्रोसाइट वेग पार अनुभाग के रूप में अनुमान हैएन डी डी v, लुमेन पोत व्यास 11.
- वी की गणना करने के लिए, पाँच कण उज्ज्वल प्रतिबिंब (आरबीसी) और चार कण धारियाँ प्रत्येक xt ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि में हरी प्रतिदीप्ति (pRBC GFP) दिखा दिखा धारियाँ के कोण (θ ) को मापने. Xy छवि पर उपाय लुमेन पोत व्यास.
- वेग तो के रूप में व्यक्त है वी = 1/tan (θ) * डी ई / डी एरिथ्रोसाइट (डी ई = 6 सुक्ष्ममापी) और लुमेन पोत व्यास के लिए सामान्य ध्.
- यों प्रत्येक पोत के लिए अलग अलग diameters के पांच xt छवियों के साथ तीन जहाजों की एक न्यूनतम.
8. सांख्यिकीय विश्लेषण
- सांख्यिकीय विश्लेषण, साजिश दिशात्मकता के लिए, वितरण घनत्व के रूप में वेग और निवास के समय मतलब और दो परजीवी लाइनों के बीच मतभेद का आकलन करने के लिए समानता की - medians STATA (IC10) में परीक्षण का उपयोग करें.
9. प्रतिनिधि परिणाम
Intravital भारतीय सैन्य अकादमीतिल्ली में GFP परजीवी के ging गतिशीलता में परजीवी के दो उपभेदों के बीच मतभेद का पता चला. एकल परजीवी की गतिशीलता मापदंडों का मात्रात्मक विश्लेषण वेग दिशात्मकता की कमी और संवर्धित 17X तनाव से संक्रमित चूहों के परजीवी के निवास समय कम संकेत दिया. इसके अलावा, बड़ा वाहिकाओं में रक्त के प्रवाह 7 उपभेदों के बीच नहीं बदल गया था . तकनीकी प्रक्रिया चित्रा 1A में प्रस्तुत किया है. चित्रा 1B FITC - लेबल लाल रक्त कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ एक माउस की एक सामान्य तिल्ली का एक सामान्य दृश्य में लाल लुगदी में ज़ूम और एक पोत (चित्रा 1 बी, 1 और 2, क्रमशः में ज़ूम) दूसरे के साथ दिखाता है. Vasculature 70 केडीए Dextran टेक्सास रेड एरिथ्रोसाइट प्रतिबिंब इसके विपरीत के साथ एक साथ इंजेक्शन द्वारा evidenced था. अन्य फ्लोरोसेंट तालिका 1 में संक्षेप रंजक Hoechst (चित्रा 1C, 1D) जैसे अंग पर जानकारी imaged किया जा रहा है, हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
17XL और 17X तनाव के परजीवी के वास्तविक समय इमेजिंग सिनेमा 1 और 2 में प्रस्तुत किया है,के साथ कुछ 17X pRBC (मूवी 2) एक रोलिंग सर्कल व्यवहार दिखा. गतिशीलता मापदंडों का मात्रात्मक विश्लेषण Z कोडित रंग छवियों की मदद के साथ व्यक्तिगत परजीवी की ट्रैकिंग के माध्यम से हासिल की थी. चित्रा 2A एक रंग जेड कोडित ढेर, जहां घेर लिया कण विभिन्न विमानों में चल होता Z प्रक्षेपण से पता चलता है. चित्रा 2B और 2C 17X और 17XL संक्रमण में अलग परजीवी के लिए पटरियों क्रमशः का प्रतिनिधित्व करते हैं,. दिशात्मकता और सभी मात्रा कणों के निवास समय से परिणाम 2d और 2E चित्रा में परजीवी जनसंख्या का घनत्व वितरण नक्शे, क्रमशः के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. Intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग तिल्ली में रक्त के प्रवाह की निगरानी करने के लिए, एरिथ्रोसाइट आंदोलन से उत्पन्न वाहिकाओं के केंद्रीय लुमेन के xt छवियों में प्राप्त धारियाँ 11 वेग की गणना करने के लिए मापा गया. छवियों को एक पोत के एक xy (चित्रा 2 एफ) के साथ इसी xt लाइन स्कैन (चित्र 2 जी) स्कैन दिखा.
| प्रतिदीप्त probई | स्थानीयकरण | एक फोटान उत्तेजना (एनएम) | 2 फोटॉन उत्तेजना (एनएम) | पता लगाया गया उत्सर्जन (एनएम) | मात्रा / माउस वजन |
| 33342 Hoechst | झिल्ली permeant - डीएनए बाध्यकारी जांच. यह (जीवित और मृत) अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद सभी कोशिकाओं के नाभिक लेबल. | 405 | 800 | 410-480 | 12.5 ग्राम / किलोग्राम |
| Propidium आयोडाइड | झिल्ली impermeant - डीएनए बाध्यकारी जांच. यह समझौता झिल्ली (apoptotic और परिगलित कोशिकाओं) के साथ कोशिकाओं के नाभिक लेबल. | 561 | 800 | 570-650 | 250 मिलीग्राम / किलोग्राम |
| ७०००० mol Dextran प्रतिदीप्त wt (FITC, टेक्सास लाल) | द्रव चरण मार्कर है कि प्लाज्मा के विपरीत को बढ़ाता है. | FITC टेक्सास 488 लाल 594 | 800 | 500-540 600-650 | 50 मिलीग्राम / किलोग्राम |
| सोडियम fluorescein | थोक तरल पदार्थ चरण albumin मार्कर है कि प्लाज्मा के विपरीत बढ़ाता है. | 488 | 800 | 500-540 | 2 mmol / किलोग्राम |
| इवांस ब्लू | थोक तरल पदार्थ चरण albumin मार्कर है कि प्लाज्मा के विपरीत बढ़ाता है. | 633 | एन डी | 645-700 | 20 मिलीग्राम / किलोग्राम |
| R6 rhodamine | महत्वपूर्ण जांच है कि सक्रिय mitochondria में जम जाता है. यह नसों में इंजेक्शन के बाद endothelia और परिसंचारी सफेद कोशिकाओं लेबल. | 561 | 800 | 570-650 | 25 मिलीग्राम / किलोग्राम |
| Fluospheres - 1micron व्यास | मोती है कि phagocytic गतिविधि के साथ कोशिकाओं के द्वारा uptaken कर रहे हैं. | 488 | 800 | 500-540 | एन डी |
| Alexa488 लेबल आतंच IIβ श्रृंखला विशिष्ट एंटीबॉडी | जांच है कि लेबल आतंच IIβ श्रृंखला | 488 | 800 | 500-540 | 0.3 मिलीग्राम / किलोग्राम |
तालिका 1 intravital माइक्रोस्कोपी के लिए प्रतिदीप्त जांच. महत्वपूर्ण है कि vivo में तिल्ली लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है विभिन्न localizations के साथ फ्लोरोसेंट रंजक. उत्तेजना / उत्सर्जन (/ Exc उन्हें) के लिए (या दो photon माइक्रोस्कोपी) एक फोटॉन हैं, बशर्ते के साथ इस्तेमाल किया जा पर्वतमाला. संकेत खुराक खारा बफर के 0.1-0.2 मिलीलीटर में भंग कर रहा है और माउस की पूंछ नस में इंजेक्शन है. एन डी [: इस अध्ययन में निर्धारित नहीं है.
चित्रा 1 तिल्ली के intravital माइक्रोस्कोपी. ए टीसीएस SP5 एक खुर्दबीन के मंच पर रखा माउस के साथ confocal खुर्दबीन Leica. माउस तिल्ली के अवर हिस्सा उजागर करना और एक कवर पर्ची के साथ बंद है. FITC - लेबल लाल रक्त कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ एक गैर संक्रमित जानवर की तिल्ली का एक प्रतिनिधि क्षेत्र के बी छवि और70 केडीए Dextran टेक्सास vasculature कल्पना लाल. परावर्तन (पीला), (नीला) Dextran और FITC - लाल रक्त कोशिकाओं (हरा) दिखाए जाते हैं. सफेद बक्से में उड़ा अप (1) खुले परिसंचरण और करीब संचलन (2) क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं. (सी) ओपन परिसंचरण और करीब संचलन (डी) 70 केडीए dextran (लाल) और 33342 Hoechst (नीला) के साथ दाग.
चित्रा 2 परजीवी गतिशीलता और रक्त का प्रवाह. एसी की मात्रा. चार आयाम (4D) में कण आंदोलन के मात्रात्मक विश्लेषण रंग कोडित छवि प्रसंस्करण का उपयोग करके मदद ए ट्रैकिंग जेड कोडित रंग छवियों, पांच अलग गहराई की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग प्रतिनिधित्व से गहराई से जानकारी के साथ प्रदर्शन किया गया था. सफेद आयत एक समय बिंदु में विभिन्न जेड में एक ही कण का प्रतिनिधित्व करता है. विभिन्न पदों अधिग्रहण के बीच समय खामियों के कारण कर रहे हैंअलग जेड छवियों की. गहराई कोड: पीला (0 सुक्ष्ममापी), (2 सुक्ष्ममापी) नारंगी, गुलाबी (4 सुक्ष्ममापी), नीला (6 सुक्ष्ममापी), हरा (8 सुक्ष्ममापी) बी, सी. कण आंदोलन के समय अनुमानों के रूप में प्रत्येक समय अंतराल के साथ रंग: ग्रे (0-2.4 सेकंड) (2.4-4.8 सेकंड) सियान, Magenta (4.8-7.0 सेकंड), लाल (7.0-9.4 सेकंड) और पीला (9.4-11.8 सेक). व्हाइट लाइन 4D 17X (11.8 एस) (बी) और 17XL (4.8 सेकंड) (सी) GFP परजीवी के कणों MTrackJ डी. GFP कणों का घनत्व के दिशात्मकता के मूल्यों (डी) द्वारा ई. वितरण और उपयोग के मार्गदर्शन ट्रैकिंग का प्रतिनिधित्व करता है निवास समय (ई). डेटा और परजीवी तीन स्वतंत्र परीक्षण समानता के medians के साथ विश्लेषण प्रयोगों से 100 FITC लेबल लाल रक्त कोशिकाओं के प्रत्येक पंक्ति के 120 कणों के अनुरूप. 17X/17XL/FITC-RBCs medians 0.53/0.75/0.85 (डी) और 4.61/0.67/0.9 सेकंड (ई) दो पंक्तियों के बीच में अंतर है.
1 और 2 फिल्म समय चूक murine (1) 17XL या 17X के साथ संक्रमित तिल्ली के intravital माइक्रोस्कोपी छवियों. (2) 10% पेरासाइटिमिया पर GFP ट्रांसजेनिक परजीवी (प्रक्षेपण Z-अधिकतम) . परजीवी और ऊतक autofluorescence हरे और लाल क्रमशः में दिखाए जाते हैं. स्केल सलाखों 10 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करते हैं और सेकंड में समय अंतराल है.
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Discussion
इस कृंतक मलेरिया मॉडल में तिल्ली के intravital माइक्रोस्कोपी के कार्यान्वयन इस अंग है जो अब तक एक "ब्लैक बॉक्स" तकनीकी कारणों की वजह से माना गया है के माध्यम से परजीवी के गतिशील यात्रा की जांच की संभावना खोला. यहाँ में, एक प्रमुख प्रयास करने के लिए एक मात्रात्मक तरीका है कि एकल और जनसंख्या के स्तर पर अलग परजीवी लाइनों के तुलनात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है अनुकूलन के लिए रखा गया था. अन्य ऊतकों और कोशिकाओं है कि मलेरिया 3,5 में किया गया था पहले imaged के विपरीत, इमेजिंग तिल्ली के माध्यम से pRBCs बीतने के तीन dimensionality और अंग के compartmentalization, अलग परिसंचरणों के साथ उपस्थिति को ध्यान में लेने की जरूरत है तेजी से और धीमी गति से 13 प्रवाह, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तेजी से एरिथ्रोसाइट वेग . इस उद्देश्य के साथ, एक विशिष्ट ऑनलाइन उपलब्ध ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग पद्धति एकल परजीवी ट्रैकिंग, गतिशीलता विश्लेषण और populatio पर लाइनों के बीच तुलना को सक्षम करने के लिए विकसित किया गया थापता स्तर. हालांकि, स्वत: सॉफ्टवेयर है कि और इस संदर्भ में एक परजीवी की पहचान और ट्रैकिंग हल के आवेदन अभी भी जरूरत है. ध्यान से, परजीवी गतिशीलता का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता मानकों पहले किया गया है अन्य अध्ययनों में वर्णित लिम्फोसाइट भर्ती और 12,14,15 vivo में आसंजन की रिपोर्ट . इस प्रकार, इस पद्धति और पैरामीटर्स में मलेरिया पालन के vivo अध्ययन में एक नया उपकरण माना जाना चाहिए. भविष्य में, हम इस तकनीक का उपयोग करें और ट्रांसजेनिक चूहों में विभिन्न कक्षों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त इमेजिंग संक्रमण द्वारा Immunobiology परजीवी तिल्ली सेल बातचीत में जानकारी हासिल करेंगे. इसके अलावा, संयोजन में ट्रांसजेनिक परजीवी GFP की तुलना में अन्य फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त की पीढ़ी इस मॉडल में छवि दोहरे संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Vivo इमेजिंग में एक शक्तिशाली उपकरण है करने के लिए अपने मेजबान के भीतर परजीवी के गतिशील परस्पर क्रिया का अध्ययन है. हालांकि, वहाँ पूर्वपहली कई सेल गतिशीलता को प्रभावित करने वाले कारकों में है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए. अलग प्लाज्मोडियम उपभेदों के साथ संक्रमण के जवाब में ऊतक वास्तुकला में परिवर्तन 7,16 ऊतक और लाल रक्त कोशिकाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हेमाटोक्रिट या अन्य hematologic मापदंडों में परिवर्तन के rheological गुण के साथ सेल बीतने के और बातचीत को संशोधित कर सकते हैं, रक्त के प्रवाह को प्रभावित कर सकते हैं और इसलिए ऊतक के साथ कोशिकाओं की बातचीत. इस कारण से, हम प्रदान की प्रक्रिया के साथ पोत रक्त के प्रवाह का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं. किसी भी confounding प्रभाव से बचने के लिए, हम एक समय बिंदु पर संक्रमित चूहों की तिल्ली imaged जब हेमाटोक्रिट reticulocytemia, और परजीवी tropism दोनों 7 संक्रमण में तुलनीय है.
इस तकनीक का संकल्प अवलोकन के लिए एक फ्लोरोसेंट पहले समय अंक (<1% पेरासाइटिमिया) पर तिल्ली के माध्यम से गुजर कोशिकाओं की अनुमति देता है. हालांकि, परजीवी के गतिशील व्यवहार के मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन किया था1% पेरासाइटिमिया पर, जब pRBCs की पर्याप्त संख्या समय चूकें है कि एकल कक्ष आंदोलन की ट्रैकिंग करने की अनुमति पर तिल्ली के माध्यम से गुजर मनाया गया. 1 फिल्में और 2, जो 10% पेरासाइटिमिया पर पशुओं के लिए अनुरूप में, हम प्रत्येक संक्रमण में तिल्ली के माध्यम से परजीवी बीतने के सामान्य पैटर्न से पता चला है, तथापि, चलती कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण जानवरों से फिल्मों में 1% पेरासाइटिमिया पर प्रदर्शन किया गया था, जहां एकल कोशिकाओं को आसानी से पीछा कर रहे हैं. तीन आयामी संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं का तेजी से आंदोलन के कारण, हम परजीवी के विकास के चरणों के बीच अंतर नहीं है, के रूप में विभिन्न प्रतिदीप्ति तीव्रता अलग लेजर की गहराई या भेद्यता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है हो सकता है.
इस प्रक्रिया के साथ, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं तिल्ली के subcapsular क्षेत्र, लाल लुगदी 17 के मुख्य रूप से बना में visualized किया जा सकता. प्लाज्मा रंगों का उपयोग करके, हम लाल लुगदी के तेजी से / बंद और / धीमी गति से और खुले परिसंचरणों के बीच विचार हो सकता है. अन्य अध्ययनों सेसफेद लुगदी का उपयोग 18 confocal या दो photon माइक्रोस्कोपी 19 में पिछले अधिक से अधिक ऊतक प्रवेश की पेशकश के साथ फ्लोरोसेंट टी कोशिकाओं की रिपोर्ट इमेजिंग,. उन में बंद लाइन और imaged किया जा रहा है क्षेत्र के पूर्व vivo लक्षण वर्णन विश्लेषण करने के लिए सही डेटा की व्याख्या के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है. इस प्रकार, तिल्ली के microcirculatory संरचना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जांच जो विशिष्ट कोशिकाओं और संरचनाओं लेबल के विकास को समझाने के प्रयासों के महत्व के हैं परजीवी मेजबान बातचीत के अध्ययन की सुविधा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम विशेष रूप से प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए और मलेरिया परजीवी के intravital माइक्रोस्कोपी में सतत इनपुट एस Graewe और वी. Heussler के लिए आभारी हैं, GFP ट्रांसजेनिक परजीवी दान ए बॉश (Confocal यूनिट, CCiT यूबी, IDIBAPS) के लिए जे बर्न्स छवि विश्लेषण और और तकनीकी सहायता के लिए मात्रा का ठहराव पी. Astola में सहायता के लिए. हम आर Tous और वीडियो उत्पादन के लिए मैं Caralt धन्यवाद. म्यूचुअल फंड कातालुन्या की व्यापकता से एक स्नातक फेलोशिप के प्राप्तकर्ता है. पड़ना एक ICREA अनुसंधान प्रोफेसर है. पड़ना की प्रयोगशाला में काम अनुदान समझौता एन के तहत यूरोपीय समुदाय सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) ° 242095, निजी फाउंडेशन CELLEX (Catalonia, स्पेन), और विज्ञान और नवाचार के स्पेनिश मंत्रालय (द्वारा वित्त पोषित है SAF2009 07,760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer Pharma GmbH | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
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