Summary
Vi visar metoden för att utföra intravital mikroskopering av mjälte med GFP transgena malariaparasiter och kvantifiering av parasiten rörlighet och blodflödet i detta organ.
Abstract
Tillkomsten av intravital mikroskopi i experimentella modeller gnagare malaria har gjort stora framsteg i kunskapen om parasit-värd interaktioner 1,2. Därmed har in vivo imaging av malariaparasiter under pre-erytrocyt steg avslöjade aktiva ingången av parasiter i noderna huden lymfkörtlar 3, den fullständiga utvecklingen av parasiten i huden 4, och bildandet av en hepatocyte som härrör merosome att försäkra migration och utsläpp av merozoites i blodet 5. Dessutom har utvecklingen av enskilda parasiter i erytrocyter har nyligen dokumenterats med hjälp av 4D avbildning och utmanade vår nuvarande syn på protein export i malaria 6. Därför har intravital imaging förändrats radikalt vår syn på viktiga händelser i Plasmodium utveckling. Tyvärr studier av dynamiska passage av malariaparasiter genom mjälten, en stor lymfoida organ anpassas vackert att rensa infekterade röda bLood celler saknas på grund av tekniska begränsningar.
Använda mus modell av malaria Plasmodium yoelii i BALB / c möss har vi genomfört intravital avbildning av mjälte och rapporterade en differentiell omdaning av den och följsamhet av parasiterade röda blodkroppar (pRBCs) till barriär celler fibroblastic ursprung i den röda massan under infektion med icke-dödliga parasiten line P.yoelii 17x till skillnad från infektioner med P.yoelii 17XL dödliga parasiten rad 7. För att nå dessa slutsatser, var en särskild metod med ImageJ fri programvara utvecklas för att möjliggöra karakterisering av snabba tredimensionella rörelse enda pRBCs. Resultat som erhållits med det här protokollet kan bestämma hastighet, riktning och uppehållstid av parasiter i mjälten, alla parametrar med inriktning på följsamhet in vivo. Dessutom rapporterar vi metoden för blodflödet kvantifiering med hjälp av intravital mikroskopi och användning av olikaolika färgämnen att få insikt i den komplexa mikrocirkulationen strukturen av mjälte.
Etik uttalande
Alla djurförsök utfördes på djuret faciliteterna på universitetet i Barcelona i enlighet med riktlinjer och protokoll har godkänts av den etiska kommittén för djurförsöksnämnden vid universitetet i Barcelona CEEA-UB (protokoll nr DMAH: 5429). Kvinna BALB / c möss av 6-8 veckors ålder erhölls från Charles River Laboratories.
Protocol
Denna metod användes i forskningen redovisas i 7.
1. Animal infektion med grönt fluorescerande protein (GFP) transgena parasiter
- P. yoelii-GFP transgena linjer 17XL och 17x genererats med samma vektorer, inriktning strategi och protokoll som beskrivs på annat håll för P. berghei 8. De uttrycker den muterade 3 variant av GFP 9 under allestädes närvarande främjare av P. berghei brottöjning 1 (Pbeef1a), som leder konstitutivt uttryck av GFP att parasiten cytosolen under hela inom erytrocyt utvecklings cykel.
- Injicera djur intraperitonealt med parasiterade röda blodkroppar (pRBCs) av P. yoelii-GFP transgena linjerna 17XL och 17x från svansen blod givare möss vid 5-10% parasitemia och spätts i PBS. Använd en dos av 5x10 5 pRBCs / mus för att nå en perifer parasitemia på 1% på dag 3 efter infectipå (pi).
- På dag 3 pi, kontrollera att parasitemia av möss infekterade med både parasiten linjer är den samma genom att göra ett blodutstryk med en droppe svans blod följt av Giemsa färgning och observation under ett ljusmikroskop med en 100x olja mål. Parasitemia uppskattas genom att beräkna andelen pRBCs över den sammanlagda röda blodkropparna i tre optiska områdena av cirka 300 röda blodkropparna.
- Styr djur injiceras med FITC-märkta röda blodkroppar kan användas för att karaktärisera förflyttning av dessa celler i normala mjälte.
2. Märkning av röda blodkroppar med FITC och injektion för att kontrollera djur
- Samla 1 ml totalt blod genom hjärtat punktion av BALB / c musen i 200 l av PBS som innehåller etylendiamintetraättiksyra tetraacetic (EDTA) (100 g / l, pH 7,4) och tvätta RBC pelleten i PBS / EDTA (0,1 g / L, pH 7,4) genom centrifugering vid 300 xgi 5 minuter (min) vid rumstemperatur (RT).
- Resuspendera 200 ìl av RBC pelleten i 300 &mu, l PBS / EDTA (0,1 g / l, pH 8) innehåller FITC (10 g / L) och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur i mörker under försiktig omrörning. Efter den tiden är supernatanten bort och cellerna tvättas fem gånger (300 xg, 5 min, RT) i PBS / EDTA (0,1 g / l, pH 7,4).
- För in vivo-experiment, späd 10 ìl av FITC-märkta RBC pelleten i 200 l av PBS och injiceras intravenöst till en BALB / c musen för att nå 1% FITC-röda blodkroppar i cirkulation.
3. Kirurgiska ingrepp
- Förbered injicerbara bedövningsmedel som består av 100 mg / kg av ketamin och 5 mg / kg av midazolam per dos beroende på vikt djuret. Injicera musen intraperitonealt med en dos av narkosmedel. Readminister hälften av den dos som var 30 min för att hålla musen på heltid sövd.
- Håll musen varm och kontrollera att musen är helt sövd (vanligtvis efter 5-20 minuter) genom att klämma foten pad innan du fortsätter.
- För attunderlätta intravenös administrering av substanser under försöket, cannulate svansen ven av musen med hjälp av en 27G kanyl. Kontrollera att nålen är väl positionerat inne i venen genom att injicera 20-50 l av saltvatten buffert och försegla den med tejp. Om det hindrar, upprepa kanylering uppströms venen. Var noga med att inte införa luftbubblor.
- Exponera sämre delen av mjälten genom ett litet snitt i huden och muskulaturen på vänster dorsala sidan av djuret. Placera mjälten där mindre andetag rörelser observeras och tillämpa PBS på den yta som exponeras för att hålla det rent av musen håret och släckt.
- Seal en cover-slip i 60x24mm med cyanoakrylatlim (Super Glue-3 Loctite) till huden runt mjälten för att möjliggöra visualisering.
4. Avbildning av levande parasiter i mjälten
- Intravital mikroskopi experiment utfördes i en Leica TCS-SP5 konfokalmikroskop (LeicaMikrosystem, Heidelberg, Tyskland) utrustad med en inkubationstid system med temperaturkontroll, en APO 63x glycerol nedsänkning objektiv (NA 1,3), resonant skanner på 8000 rader / s och en Argon (488 nm) och HeNe (594 nm, 633 nm) lasrar. Ytterligare lasrar, som blå diod (405 nm) och diod-pump-solid state (561 nm), kan krävas för excitation av sonder som anges i tabell 1.
- Placera djuret på scenen i mikroskop med locket-halkade mjälte nedåt till målet. En allmän bild av mikrocirkulationen struktur mjälten kan som tillval visualiseras med hjälp av ett 20x objektiv. RBC reflektion kontrast kan vara till hjälp att välja olika regioner av intresse för bild vid högre förstoring efteråt.
- Fokus de utvalda regionerna av intresse med 63x glycerol nedsänkning objektiv med hjälp av vävnad autofluorescens. GFP parasiter observeras passerar genom olika delar av mjälte.
- Fluorescens spelas in på två olika Channels (excitation / emission våglängd 488/505-580 nm för FITC / GFP och 488/570-630 nm för mjukpapper autofluorescens) med hål satt till 3,0 Airy enheter. RBC reflektion (488/480-495 nm), tillsammans med fluorescerande färger för att märka blod kärlsystemet (se tabell 1), används för att få ytterligare information om zonen som avbildas och i blodflödet experiment som beskrivs nedan.
- Ta bilder genom fem Z-stackar som täcker ett djup av 8 ìm på grund av de tre dimensionerna av organet, med en hastighet på 8 kHz för att skapa videor av 1,5 min.
- Spela in videor av olika zoner av mjälte för kvantitativ analys.
5. Intravital mikroskopi av mikrocirkulation av mjälte och bild förvärv för blod flödesmätning
- Vital fluorescerande prober löst i isoton koksaltlösning kan injiceras i svansvenen under experimentet att bilden kärlsystemet och få insikt i strukturen av mjälte. En listaav sonder och deras tillämpning redovisas i tabell 1 10.
- Att märka kärlsystemet med fluorescerande dextran, förbereda 1 mg 70 kDa dextran märkta med Texas Red i 100 l av saltvatten buffert.
- Använd kanylerade svansvenen att injicera fluorescerande dextran till djuret som avbildas.
- Ställ fartyg horisontellt, i riktning mot laserskanning, optiska fältet rotation (som inte påverkar hastigheten). Använd XY och XT line scanning lägen i centrala lumen av fartyget. Använd dubbelriktad skanning med en linje i genomsnitt 32 med en hastighet av 8 kHz för att få en bild av 512x512 pixlar.
- Hämta bilder av fartyg på tre olika kanaler (excitation / emission våglängd 488/505-580 nm, 594/605-660 nm, 488/480-495 nm för FITC / GFP, dextran-Texas Red och erytrocytporfobilinogen reflektion, respektive).
- Ta bilder av fartyg med olika diameter och över olika faser av hjärtcykeln för att kompensera för variationer. I dessa bilder kommer streck till följd av att flytta celler som används för att kvantifiera blodflödet 11.
6. Bildbehandling och kvantitativ analys av parasiten rörlighet med hjälp av ImageJ programvara
- Skapa en video i realtid från bildsekvensen genereras med hjälp av ImageJ (version 1.39o, Wayne Rasband, NIH, www.macbiophotonics.ca ).
- Öppna ". LIF"-fil i ImageJ hålla "xyzct" sekvens och separerade kanaler.
- Registrera användbar information från metadata filen: dblvoxelX-Voxel-bredd, dblvoxelY-Voxel-höjd, dblvoxelZ-Voxel djupgående och ram intervall mellan två Z-ramar och mellan staplar. Denna information kommer att användas för kalibrering.
- Subtrahera autofluorescens (kanal 2) för att GFP-parasit bilder (kanal 1). Filtrera bilder med Gaussisk oskärpa = 1. Vänligen minns att använda Filtret Gaussisk oskärpa i bilderna måste deklareras för publications. Spara filen "animal1_m1_substract.seq".
- En Z-färgkodade video skapas som stödjande material för kvantitativ analys av parasit rörligheten, eftersom det kommer att underlätta en enda partikel identifiering i partiklar i hög hastighet och Z-rörelse karakterisering.
- Konvertera bunten till Image 5D, med tredje dimensionen är den Z och fjärde dimensionen är tiden. Ge en annan färg till varje Z och overlay.
- Projekt alla Z med maximal intensitet över alla tidsramar för att skapa en Z-färgkodade video. Spara som "animal1_m1_Z_color.avi".
- Klassificera och märka alla de partiklar som visas i de första 10 tidsramar för videon efter antalet bildrutor är bosatt (från 1 till 10). I varje video, kommer 20 partiklar spåras efter de erhållna proportionerna. Totalt kommer 120 parasiter kvantifieras från 3 djur, med sex video / djur som representerar olika zoner av mjälte.
- Rapport ramarna är bosatt på varje Zoch över hela filmen för alla de partiklar som ska kvantifieras.
- Utför 4D (x, y, z, t) manuell spårning av partiklar med MTrackJ plugin (skriven av E. Meijering). Öppna filen "animal1_m1_substract.seq" som bild 5D och ange bildegenskaper hjälp av den information som registrerats före från pixel bredd, höjd, djup (i mikrometer) och stapla intervall (i sekunder). Konfigurera banan inställningarna enligt följande: "Flytta till nästa gång" och "tillämpar lokala markören ljusstark centroid/25x25pixel". Konfigurera visar: "visa ursprung", "visa bild", "Visa aktiva spåret", "Visa endast spår i de nuvarande kanalerna", "Visa endast spår pekar på aktuell tid".
- Lägg till ett spår för varje partikel. Tänk rörelse i Z-axeln endast om förskjutning är högre än 6 ìm (genomsnittlig diameter för en pRBC). Följ partikeln över maximalt 100 bilder.
- Rädda x, y, z-och t-koordinater mäts från spåret som "animal1_m1_p1". Xls.
- Åtgärder för deplacement (D = ROT ((x slutlig-X inital) 2 + (y sista-y inital) 2 + (z sista-z inital) 2), väglängd (P = Σ n = 0 → sista ROT ((x n +1-x n) 2 + ( y n +1-y n) 2 + (z n 1-z n) 2) med n som visar varje position spåras, medelhastighet och uppehållstid kan beräknas med hjälp av värden från x, y, z, t koordinater spåras kalibrerad enligt de registrerade uppgifterna. är riktverkan av partiklarna definieras som kvoten av förskjutning vs längd, med värden på nära 1 indikerar riktad rörelse och värden nära 0 indikerar återhållen rörelse 12. En mall för beräkningar underlättas bifogas.
7. Beräkning av volymetriska blodflödet
- Volymetrisk blodflöde beräknas som Q = V * π * D v 2 / 4, med V, erytrocyt hastighet över tvärsnittet ennd D mot, lumen fartyg diameter 11.
- För att beräkna V, mäta vinklar (θ) med fem partikel streck som visar ljus reflektion (RBC) och fyra streck partikel visar grön fluorescens (pRBC-GFP) i varje xt bilden med ImageJ programvara. Mät lumen fartyg diameter på xy bilden.
- Hastigheten är då uttrycks som V = 1/tan (θ) * D e / D mot att normalisera för erytrocyt (D e = 6 mikrometer) och lumen diameter fartyg.
- Kvantifiera minst tre fartyg med olika diametrar och fem xt bilder för varje fartyg.
8. Statistisk analys
- För statistisk analys, tomt riktverkan, menar hastighet och uppehållstid som densitet distributioner och använder jämlikhet-of-medianer test i STATA (IC10) för att bedöma skillnaderna mellan de två parasit linjerna.
9. Representativa resultat
Intravital imaGing av GFP parasiter i mjälten framkom skillnader i rörlighet mellan de två stammar av parasiter. Kvantitativ analys av rörlighet parametrar för enstaka parasiter som anges reducerad hastighet, brist på riktning och utökade uppehållstid av parasiter av möss infekterade med 17x stam. Dessutom var volymetrisk blodflöde i kärlen inte ändras mellan stammar 7. Det tekniska förfarandet presenteras i Figur 1A. Figur 1B visar en generell bild av en normal mjälte från en mus injiceras med FITC-märkta röda blodkropparna, med en zoom in i den röda massan och en annan att ett fartyg (Figur 1B, zooma in 1 respektive 2). Kärlsystemet bevisades genom att injicera 70 kDa Dextran-Texas Red tillsammans med erytrocyt reflektion kontrast. Andra fluorescerande färger sammanfattas i tabell 1 kan användas för att få information om orgeln som avbildas, som Hoechst (Figur 1C, 1D).
Realtid avbildning av parasiter i 17XL och 17x stam presenteras i filmer 1 och 2,med några 17x-pRBC (Film 2) visar ett rullande cirkel beteende. Kvantitativ analys av rörlighet parametrarna uppnåddes genom spårning av enskilda parasiter med hjälp av Z-kodade färgbilder. Figur 2a visar en Z-projektion av en Z-färgkodade stack, där inringade partikel tycks röra sig i olika plan. Figur 2B och 2C utgör spår för olika parasiter i 17x och 17XL infektion, respektive. Resultat från riktning och uppehållstiden för alla kvantifierat partiklar presenteras som en densitet distribution karta av parasit befolkningen i figur 2D och 2E, respektive. För att övervaka blodflödet i mjälten med intravital mikroskopi var strimmor erhållits i xt bilder av den centrala lumen av fartyg till följd av erytrocyt rörelsen mäts för att beräkna hastigheten 11. Bilderna visar en xy-skanning av ett fartyg (Figur 2F) med motsvarande xt linjen skanning (Figur 2G).
| Fluorescerande Probe | Lokalisering | 1 photon excitation (nm) | 2 photon excitation (nm) | Upptäckta utsläpp (nm) | Antal / mus vikt |
| Hoechst 33.342 | Membran-permeant DNA-bindande sond. Det etiketter kärnor av alla celler (levande och döda) efter intravenös injektion. | 405 | 800 | 410-480 | 12,5 g / kg |
| Propidiumjodid | Membran-impermeant DNA-bindande sond. Det etiketter kärnor av celler med nedsatt membran (apoptotiska och nekrotiska celler). | 561 | 800 | 570-650 | 250 mg / kg |
| 70.000 mol wt Dextran-fluorescerande (FITC, Texas Red) | Fluid-fas markör som förstärker kontrasten på plasma. | FITC 488 Texas Red 594 | 800 | 500-540 600-650 | 50 mg / kg |
| Natrium Fluorescein | Bulk vätskefasen albumin markör som förstärker kontrasten i plasma. | 488 | 800 | 500-540 | 2 mmol / kg |
| Evans Blue | Bulk vätskefasen albumin markör som förstärker kontrasten i plasma. | 633 | nd | 645-700 | 20 mg / kg |
| Rhodamine R6 | Vital sond som ackumuleras i aktiva mitokondrier. Det etiketter endothelia och cirkulerande vita blodkroppar efter intravenös injektion. | 561 | 800 | 570-650 | 25 mg / kg |
| Fluospheres-1micron diameter | Pärlor som uptaken av celler med fagocyterande förmåga. | 488 | 800 | 500-540 | nd |
| Alexa488-märkta fibrin IIβ chain-specifik antikropp | Sond att etiketterna fibrin IIβ kedja | 488 | 800 | 500-540 | 0,3 mg / kg |
Tabell 1. Fluorescerande prober för intravital mikroskopi. Vital fluorescerande färger med olika lokaliseringar som kan användas för att märka mjälten in vivo. Excitation / emission (Exc / em) varierar för att användas med en-foton (eller två foton mikroskopi) tillhandahålls. Den dos som anges löses upp i 0,1-0,2 ml koksaltlösning buffert och injiceras till svansvenen av musen. [ND: Ej fastställt i denna studie.
Figur 1. Intravital mikroskopering av mjälte. A. Leica TCS-SP5 konfokalmikroskop med en mus som släppts ut på scenen i mikroskop. Musen har den sämre delen av mjälten exponerade och förseglade med lock-slip. B. Bilden av en representativ del av mjälten av en icke-infekterade djur injiceras med FITC-märkta röda blodkroppar och70 kDa Dextran-Texas Red att visualisera kärlsystemet. Reflektion (gul), är Dextran (blå) och FITC-röda blodkropparna (grön) visas. Blow-ups i vita rutor representerar öppen cirkulation (1) och stäng-omlopp (2) områden. Open-cirkulation (C) och nära cirkulation (D) färgad med 70 kDa dextran (röd) och Hoechst 33.342 (blå).
Figur 2. Kvantifiering av parasit rörlighet och blodflödet. AC. Kvantitativ analys av partikel rörelse i fyra dimensioner (4D) underlättas genom att använda färgkodade bildbearbetning. Utfördes med fördjupad information från Z-kodade färgbilder, företrädd med maximal intensitet projektion av fem olika djup A. Tracking. Vit rektangel representerar samma partikel på olika Z i en tidpunkt. Olika befattningar beror på tid förfaller mellan förvärvetav olika Z bilder. Djup-kod:. Gul (0 mikrometer), orange (2 mikrometer), rosa (4 mikrometer), blå (6 mikrometer), grön (8 mikrometer) B, C. Tid projektioner av partikel rörelse med varje tidsintervall färgade som: grå (0-2,4 sek), cyan (2,4 till 4,8 sek), magenta (4,8 till 7,0 sek), röd (7,0 till 9,4 sek) och gula (9,4-11,8 sek). Vita linjen representerar 4D manuell spårning av partiklar av 17x (11,8 s) (B) och 17XL (4,8 sek) (C) GFP parasiter med hjälp av MTrackJ. D, E. Fördelning av tätheten av GFP partiklar med värden för riktverkan (D) och uppehållstid (E). Data motsvara 120 partiklar av varje rad av parasiter och 100 FITC-märkta röda blodkroppar från tre oberoende försök analyseras med jämställdhet-of-medianer test. Den 17X/17XL/FITC-RBCs medianer är 0.53/0.75/0.85 (D) och 4.61/0.67/0.9 sek (E). Skillnader mellan de två linjerna i
Filmer 1 och 2. Time-lapse intravital mikroskopi bilder av murina mjälte infekterade med 17XL (1) eller 17x (2) GFP-transgena parasiter på 10% parasitemia (Z-max projektion). Parasit och vävnad autofluorescens visas i grönt och rött respektive. Skala staplarna representerar 10 mikrometer och tidsintervallet är i sek.
v "> Klicka här för att se film 1.
Klicka här för att titta på film 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genomförandet av intravital mikroskopi av mjälte i denna gnagare malaria modell öppnat möjligheten att undersöka den dynamiska passage av parasiter genom detta organ som hittills ansetts vara en "black-box" på grund av tekniska överväganden. Här inne var en stor insats sätter att anpassa en kvantitativ metod som tillåter jämförande analys av olika parasit rader vid enstaka och befolkning nivåer. I motsats till andra vävnader och celler som hade avbildad tidigare i malaria 3,5 behöver avbildning passagen av pRBCs genom mjälten att beakta de tre dimensionerna och uppdelning av orgeln, förekomsten av olika upplagor med snabba och långsamma flux 13, liksom den snabba hastigheter erytrocyt. I detta syfte har en särskild metod att använda nätet som finns ImageJ programvara utvecklad för att enstaka parasit spårning, rörlighet analys och jämförelse mellan raderna på population nivå. Dock är tillämpningen av automatiska program som löser identifiering och spårning av enstaka parasiter i detta sammanhang fortfarande behövs. Att notera, har de parametrar som används för att beskriva parasit rörlighet tidigare har beskrivits i andra studier att rapportera lymfocyter rekrytering och vidhäftning in vivo 12,14,15. Därför bör denna metod och parametrar betraktas som ett nytt verktyg för in vivo-studier av följsamhet i malaria. I framtiden kommer vi att använda denna teknik för att få insikt i immunbiologi och parasit-mjälte interaktioner cell imaging infektion i transgena möss som uttrycker fluorescerande reporter gener i olika celler. Dessutom kan den generation av transgena parasiter uttrycka fluorescerande markörer än GFP användas i kombination för att bilden dubbla infektioner i denna modell.
In vivo imaging är ett kraftfullt verktyg för att studera dynamiska samspelet av parasiter inom sina värdar. Men det finns exist flera faktorer som påverkar cellens rörlighet som måste beaktas. Förändringar i vävnaden arkitekturen i svar på infektion med olika Plasmodium stammar kan ändra cell passage och interaktion med vävnad 7,16 och reologiska egenskaper av röda blodkroppar, liksom förändringar i hematokrit eller andra hematologiska parametrar, kan påverka blodflödet och därmed samspelet mellan celler med vävnaden. Av denna anledning rekommenderar vi att analysera flödet fartyg blod med de medföljande förfarande. För att undvika störande effekter, avbildas vi mjälte från infekterade möss vid en tidpunkt då hematokrit, reticulocytemia och parasit tropism är jämförbar i båda infektionerna 7.
Lösningen av denna teknik gör det möjligt för observation av enstaka fluorescerande celler passerar genom mjälten vid tidigare tidpunkter (<1% parasitemia). Emellertid var kvantitativ analys av dynamiska beteende av parasiter som utförspå 1% parasitemia, var när tillräckligt många pRBCs observerade passerar genom mjälten vid tidpunkt förfaller som gör att spåra enda cell rörelse. I filmer 1 och 2, som motsvarar djur vid 10% parasitemia visade vi det allmänna mönstret för parasiten passagen genom mjälten i varje infektion, men var kvantitativ analys av rörliga celler som utförs i filmer från djur vid 1% parasitemia, där enstaka celler är lätt följas. På grund av den snabba tredimensionella flödet av infekterade röda blodkroppar, kunde vi inte skilja mellan utvecklingsstadier av parasiten, som olika fluorescens intensiteter kunde hänföras till olika djup eller GENOMTRÄNGLIGHET av laser.
Med detta förfarande kan fluorescerande celler kan visualiseras i subkapsulär zon mjälte, bestående huvudsakligen av röd massa 17. Genom att använda plasma färgämnen, kunde vi urskilja mellan snabba / stängd och långsam / öppna upplagor av den röda massa. Andra studierhar rapporterat avbildning av fluorescerande T-celler i vitt fruktkött med konfokala 18 eller två foton mikroskopi 19, med sista erbjuda bättre in i vävnaderna. I dessa är off-line analys och ex vivo karakterisering av zonen som avbildas en viktig faktor för att korrekt tolka data. Således ansträngningar att upplysa mikrocirkulationen struktur mjälte, samt utveckling av sonder den etiketten specifika celler och strukturer, är av betydelse för att underlätta studiet av parasit-värd interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är särskilt tacksamma mot S. Graewe och V. Heussler för grundutbildning och kontinuerlig inmatning i intravital mikroskopi av malariaparasiter, till J. Burns för att donera GFP transgena parasiter, till A. Bosch (Confocal Unit, CCIT-UB, IDIBAPS) för att få hjälp inom bildanalys och kvantifiering och P. Astola för tekniskt stöd. Vi tackar R. Tous och jag Caralt för videoproduktion. MF är mottagare av en examen stipendium från det generella i Katalonien. HAP är en ICREA forskning professor. Arbete i laboratorium HAP finansieras av Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr 242.095, av de privata stiftelsen Cellex (Katalonien, Spanien), och av det spanska ministeriet för vetenskap och innovation ( SAF2009-07.760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer Pharma GmbH | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. vander, R, A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. The complete spleen. , Totowa. Humana Press. (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
