Summary
Vi viser metoden for å utføre intravital mikroskopi av milten bruker GFP transgene malaria parasitter og kvantifisering av parasitt mobilitet og blodstrøm i dette organet.
Abstract
Ankomsten av intravital mikroskopi i eksperimentelle gnager malaria modeller har gjort store fremskritt til kunnskap om parasitt-vert interaksjoner 1,2. Dermed har in vivo avbildning av malaria parasitter under pre-erythrocytic stadier avslørte den aktive inngangen av parasitter i huden lymfeknuter 3, den fullstendige utviklingen av parasitten i huden 4, og dannelsen av en hepatocytter-avledet merosome å sikre migrasjon og utgivelsen av merozoites i blodet 5. Videre har utviklingen av de enkelte parasitter i erytrocytter nylig blitt dokumentert ved hjelp av 4D-avbilding og utfordret vårt nåværende syn på protein eksport i malaria 6. Dermed har intravital bildebehandling radikalt forandret vårt syn på viktige hendelser i Plasmodium utvikling. Dessverre studier av dynamiske passasje av malaria parasitter gjennom milten, en stor lymfoid organ utsøkt tilpasset for å fjerne infiserte røde blood celler mangler på grunn av tekniske begrensninger.
Bruke murine modell av malaria Plasmodium yoelii i BALB / c mus, har vi implementert intravital avbildning av milten og rapporterte en differensial ombygging av det og etterlevelse av parasitized røde blodceller (pRBCs) til barriere celler fibroblastic opprinnelse i den røde fruktkjøttet under infeksjon med ikke-dødelig parasitt linje P.yoelii 17x i motsetning til infeksjoner med P.yoelii 17XL dødelig parasitt linje 7. For å nå disse konklusjonene, ble en bestemt metodikk bruker ImageJ fri programvare utviklet for å muliggjøre karakterisering av den raske tre-dimensjonal bevegelse av single-pRBCs. Resultater oppnådd med denne protokollen tillater bestemme hastigheten, retningen og oppholdstid av parasitter i milten, alle parametere adressering tilslutning in vivo. I tillegg rapporterer vi metodikken for blodstrøm kvantifisering bruker intravital mikroskopi og bruk av DIFlige fargestoffer å få innsikt i de komplekse microcirculatory strukturen av milten.
Etikk uttalelse
Alle dyrestudier ble utført på dyr fasilitetene på University of Barcelona i samsvar med retningslinjer og protokoller godkjent av komité for forsøk med dyr av University of Barcelona CEEA-UB (protokoll DMAH: 5429). Kvinne BALB / c mus på 6-8 ukers alder ble hentet fra Charles River Laboratories.
Protocol
Denne metoden ble brukt i forskning rapportert i syv.
1. Animal infeksjon med grønt fluorescerende protein (GFP) transgene parasitter
- P. yoelii-GFP transgene linjer av 17XL og 17x ble generert ved hjelp av samme vektorer, målrettingsstrategien og protokoller som er beskrevet andre steder for P. berghei 8. De uttrykker den muterte 3 varianten av GFP 9 under den allestedsnærværende formidler av P. berghei forlengelse faktor 1 (Pbeef1a), som leder konstituerende uttrykk for GFP til parasitt cytosol under hele intra-erythrocytic utvikling syklus.
- Injiser dyr intraperitonealt med parasitized røde blodceller (pRBCs) av P. yoelii-GFP transgene linjer 17XL og 17x hentet fra halen blod donor mus på 5-10% parasitemia og fortynnet i PBS. Bruk en dose av 5x10 5 pRBCs / mus å nå en perifer parasitemia på 1% på dag 3 etter infectipå (pi).
- På dag 3 pi, sjekk at parasitemia av mus infisert med både parasitt linjene er den samme ved å gjøre et blodutstryk med en dråpe hale blod etterfulgt av Giemsa flekker og observasjon under et lysmikroskop med en 100x olje mål. Parasitemia er estimert ved å beregne prosentandelen av pRBCs enn total RBCs i tre optiske felt av ca 300 RBCs.
- Kontroll dyrene injisert med FITC-merket RBCs kan brukes til å karakterisere bevegelsen av disse cellene i normal spleens.
2. Merking av røde blodceller med FITC og injeksjon for å kontrollere dyr
- Samle 1 ml av totalt blod gjennom kardiale punktering av en BALB / c mus i 200 mL PBS inneholder etylen diamine tetraacetic acid (EDTA) (100 g / L, 7,4 pH) og vask RBC pellet i PBS / EDTA (0,1 g / L, 7,4 pH) gjennom sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter (min) ved romtemperatur (RT).
- Resuspender 200 mL av RBC pellet i 300 ogmu; l PBS / EDTA (0,1 g / L, 8 pH) som inneholder FITC (10 g / L) og inkuber i 2 timer ved romtemperatur i mørket med forsiktig omrøring. Etter den tid er supernatanten fjernes og cellene vasket fem ganger (300 xg, 5 min, RT) i PBS / EDTA (0,1 g / L, pH 7,4).
- For in vivo eksperimenter, fortynne 10 mL av FITC-merket RBC pellet i 200 mL PBS og injisere intravenøst til en BALB / c mus for å nå 1% FITC-RBCs i omløp.
3. Kirurgiske prosedyrer
- Forbered injiserbare bedøvelse sammensatt av 100 mg / kg av ketamin og 5 mg / kg av Midazolam per dose i henhold til vekten av dyret. Injiser musen intraperitonealt med én dose bedøvelse. Readminister halvparten av dosen hver 30 min å holde musen heltid bedøvet.
- Hold musen varm og kontroller at musen er helt bedøvd (vanligvis etter 5-20 min) ved å klemme foten puten før du fortsetter.
- For ålette intravenøs administrasjon av stoffer i løpet av eksperimentet, cannulate halen vein av musen med en 27g kanyle. Sjekk at nålen er godt posisjonert inne i venen ved å injisere 20-50 mL av saltvann buffer og forsegle den med tape. Hvis det hindrer, gjenta cannulation oppstrøms av venen. Vær nøye med å ikke innføre luftbobler.
- Avdekk mindreverdig del av milten gjennom et lite snitt i huden og muskulaturen på venstre dorsal side av dyret. Plasser milt der mindre pust bevegelse er observert og anvende PBS på overflaten utsatt for å holde det rent av musen hår og hydrert.
- Seal en cover-slip på 60x24mm med cyanoakrylater lim (Super Glue-3 Loctite) til huden rundt milten å tillate visualisering.
Fire. Avbildning av levende parasitter i milten
- Intravital mikroskopi eksperimenter ble utført i en Leica TCS-SP5 confocal mikroskop (LeicaMicrosystems, Heidelberg, Tyskland) er utstyrt med en inkubasjonstid system med temperaturkontroll, en APO 63x glyserol nedsenking objektiv (NA 1.3), resonant scanner på 8000 linjer / s og en Argon (488 nm) og HeNe (594 nm, 633 nm) lasere. Ekstra lasere, for eksempel blå diode (405 nm) og diode-pumpe-solid state (561 nm), kan være nødvendig for eksitasjon av prober oppført i tabell 1.
- Plasser dyret på scenen av mikroskopet med cover-gled milt vendt ned til målet. En generell visning av microcirculatory strukturen i milten, kan man få visualisert ved hjelp av en 20x objektiv. RBC refleksjon kontrast vil være nyttig å velge ulike regioner av interesse for bildet ved høyere forstørrelse etterpå.
- Fokus på utvalgte regioner av interesse med 63x glyserol nedsenking objektiv bruke vev autofluorescence. GFP parasitter er observert passerer gjennom ulike områder av milten.
- Fluorescens er spilt inn på to forskjellige channels (eksitasjon / utslipp bølgelengde 488/505-580 nm for FITC / GFP og 488/570-630 nm for vev autofluorescence) med pinhole satt til 3,0 Airy enheter. RBC refleksjon (488/480-495 nm), sammen med fluorescerende fargestoffer å merke blodet blodkar (se tabell 1), brukes til å innhente ytterligere informasjon om sonen blir fotografert og i blodstrømmen eksperimentene beskrevet nedenfor.
- Ta bilder gjennom fem Z-stabler dekker en dybde på 8 mikrometer grunn av tredimensjonalitet av orgelet, med en hastighet på 8 kHz for å generere videoer på 1,5 min.
- Record videoer av ulike soner av milten for kvantitativ analyse.
5. Intravital mikroskopi av microvasculature av milten og bilde oppkjøpet for blodstrøm måling
- Vital fluorescerende prober oppløst i fysiologisk saltvann kan injiseres til halen venen under forsøket til bildet blodkar og få innsikt i strukturen i milten. En listeav prober og deres søknad er presentert i tabell 1 10.
- Å merke det vaskulære system med fluorescerende dekstran, forbered 1 mg på 70 kDa dekstran merket med Texas Red i 100 mL av saltvann buffer.
- Bruk cannulated halen vein å injisere fluorescerende dekstran til dyret blir avbildes.
- Still skipene horisontalt, i retning av laserskanning, ved optisk felt rotasjon (ikke påvirker hastighet). Bruk xy og xt linje skannemodi i den sentrale lumen av fartøyet. Bruk toveis skanning med en linje gjennomsnitt på 32 med en hastighet på 8 kHz for å få et bilde av 512x512 piksler.
- Skaff bilder av skip på tre forskjellige kanaler (eksitasjon / utslipp bølgelengde 488/505-580 nm, 594/605-660 nm, 488/480-495 nm for FITC / GFP, dekstran-Texas Red og erytrocytt refleksjon, henholdsvis).
- Ta bilder av fartøy med ulike diametre og over forskjellige faser av hjertestans syklusen for å kompensere for svingninger. I disse bildene vil striper som skyldes flytting celler brukes til å kvantifisere blodstrømmen 11.
Seks. Bildebehandling og kvantitativ analyse av parasitt mobilitet bruke ImageJ programvare
- Lag en real-time video fra bildet sekvens generert ved hjelp ImageJ programvaren (versjon 1.39o, Wayne Rasband, NIH, www.macbiophotonics.ca ).
- Åpne ". LIF"-filen i ImageJ holde "xyzct" sekvens og separert kanaler.
- Registrer litt nyttig informasjon fra metadatafilen: dblvoxelX-voxel-bredde, dblvoxelY-voxel-høyde, dblvoxelZ-voxel dyptgående og ramme intervall mellom påfølgende Z-rammer og mellom stabler. Denne informasjonen vil bli brukt til kalibrering.
- Trekk autofluorescence (kanal 2) til GFP-parasitt bilder (kanal 1). Filter bildene med Gaussian Blur = 1. Vennligst huske at det å bruke Gaussian Blur filteret i bildene må erklæres for publications. Lagre filen "animal1_m1_substract.seq".
- En Z-kodet farge video er opprettet som støttende materiale for kvantitativ analyse av parasitt mobilitet, da det vil lette single-partikkel identifikasjon i rask bevegelse partikler og Z-bevegelse karakterisering.
- Konverter stabelen til bilde 5D, med tredje dimensjon er den Z og fjerde dimensjon som den gang. Gi en annen farge til hvert Z og overlay.
- Prosjektet alle Z bruke maksimal intensitet over hele tiden rammer for å skape en Z-kodet farge video. Lagre som "animal1_m1_Z_color.avi".
- Klassifisere og merke alle partiklene som vises i de første 10 tidsrammer av videoen i henhold til antall bilder bosatt (fra 1 til 10). I hver video, vil 20 partikler spores etter proporsjonene innhentet. Totalt vil 120 parasitter kvantifiseres fra 3 dyr, ved hjelp av seks videoer / dyr som representerer ulike soner av milten.
- Rapport rammene av opphold på hvert Zog over hele filmen for alle partiklene å være kvantifisert.
- Utfør 4D (x, y, z, t) manuell sporing av partikler med MTrackJ plugin (skrevet av E. Meijering). Åpne filen "animal1_m1_substract.seq" som bilde 5D og still image egenskaper ved hjelp av informasjonen er registrert før fra pixel bredde, høyde, dybde (i mm) og stable intervall (i sekunder). Konfigurer sporet innstillingene slik: "flytte til neste gang" og "gjelder lokale markør lys centroid/25x25pixel". Konfigurer visning: "show opprinnelse", "show image", "viser aktivt track", "viser bare spor til stede i dagens kanaler", "Vis bare sporpunkt på nåværende tidspunkt".
- Legg til et spor for hver partikkel. Tenk bevegelse i Z-aksen bare hvis deplasement er høyere enn 6 mikrometer (gjennomsnittlig diameter for en pRBC). Følg partikkel over maksimalt 100 bilder.
- Redd x, y, z og t koordinater målt fra sporet som "animal1_m1_p1". Xls.
- Tiltak for forskyvning (D = sqrt ((x finalen-X inital) 2 + (y endelig-y inital) 2 + (z endelig-z inital) 2); banelengde (P = Σ n = 0 → endelig sqrt ((x n +1-x n) 2 + ( y n +1-y n) 2 + (z n +1-z n) 2) med n indikerer hver posisjon spores, betyr hastighet og oppholdstid kan beregnes ved hjelp av verdier fra x, y, z, t koordinater spores kalibrert henhold til data registrert. direksjonalitet av partikler er definert som kvotienten av forskyvning vs banelengde, med verdier for nær 1 indikerer regissert bevegelse og verdier nær 0 indikerer behersket bevegelse 12. En mal for beregningene er tilrettelagt vedlagt.
7. Beregning av volumetrisk blodstrøm
- Volumetrisk blodstrøm er beregnet som Q = V * π * D v 2 / 4, med V, erytrocytt hastighet over tverrsnittet ennd D v, lumen fartøy diameter 11.
- For å beregne V, måle vinkler (θ) av fem partikkel streker som viser lyse refleksjon (RBC) og fire partikkel streker viser grønn fluorescens (pRBC-GFP) i hver xt bildet ved hjelp ImageJ programvare. Mål lumen fartøy diameter på xy bildet.
- Hastigheten er da uttrykkes som V = 1/tan (θ) * D e / D v å normalisere for erytrocytt (D e = 6 mm) og lumen fartøy diameter.
- Kvantifisere et minimum av tre skip med ulike diametre og fem XT bilder for hvert fartøy.
8. Statistisk analyse
- For statistisk analyse, plot retningen, mener hastighet og oppholdstid som tetthet distribusjoner og bruke likestilling-of-medianer test i Stata (IC10) for å vurdere forskjeller mellom de to parasitt linjer.
9. Representant Resultater
Intravital IMAGing av GFP parasitter i milten viste forskjeller i mobilitet mellom de to stammer av parasitter. Kvantitativ analyse av mobilitet parametere av enkelt parasitter indikerte redusert hastighet, mangel på retningen og utvidet oppholdstid av parasitter hos mus infisert med 17x belastning. Videre ble volumetrisk blodstrøm i fartøy ikke endret mellom stammer 7. Den tekniske prosedyren er presentert i figur 1A. Figur 1B viser en generell visning av en normal milt av en mus injisert med FITC-merket RBCs, med en zoom inn i den røde fruktkjøttet og en annen til et fartøy (figur 1B, zoom i 1 og 2, henholdsvis). Blodkar ble bevist ved å injisere 70 kDa Dextran-Texas Red sammen med erytrocytt refleksjon kontrast. Andre fluorescerende fargestoffer oppsummert i tabell 1 kan brukes til å få informasjon om orgelet blir fotografert, slik som Hoechst (figur 1C, 1D).
Real-time avbildning av parasitter av 17XL og 17x belastning er presentert i Movies 1 og 2,med noen 17x-pRBC (Movie 2) viser et rullende-sirkel atferd. Kvantitativ analyse av mobilitet parametre ble oppnådd gjennom sporing av individuelle parasitter ved hjelp av Z-kodet fargebilder. Figur 2a viser en Z-projeksjon av en Z-kodet farge stack, der omkranset partikkel vises beveger seg i forskjellige plan. Figur 2B og 2C representerer sporene for ulike parasitter i 17x og 17XL infeksjon, henholdsvis. Resultater fra direksjonalitet og oppholdstid av alle partikler kvantifisert presenteres som en tetthet distribusjon kart over parasitt befolkningen i Figur 2D og 2E, henholdsvis. Å overvåke blodstrømmen i milten bruker intravital mikroskopi ble striper innhentet i xt bilder av sentrale lumen av fartøy som følge av erytrocytt bevegelsen målt til å beregne hastighet 11. Bildene viser en xy scan av et fartøy (figur 2F) med tilsvarende XT linjen scan (figur 2G).
| Fluorescent probe | Lokalisering | Ett foton Excitation (nm) | 2 foton Excitation (nm) | Oppdaget utslipp (nm) | Antall / mus vekt |
| Hoechst 33342 | Membran-permeant DNA-bindende probe. Det etiketter kjerner av alle celler (levende og døde) etter intravenøs injeksjon. | 405 | 800 | 410-480 | 12,5 g / Kg |
| Propidium iodide | Membran-impermeant DNA-bindende probe. Det etiketter atomkjerner av celler med skadet membran (apoptotiske og nekrotiske celler). | 561 | 800 | 570-650 | 250 mg / Kg |
| 70000 mol WT Dextran-Fluorescent (FITC, Texas Red) | Fluid-fase markør som forbedrer kontrasten i plasma. | FITC 488 Texas Red 594 | 800 | 500-540 600-650 | 50 mg / Kg |
| Sodium Fluorescein | Bulk fluid-fasen albumin markør som forbedrer kontrasten i plasma. | 488 | 800 | 500-540 | 2 mmol / Kg |
| Evans Blue | Bulk fluid-fasen albumin markør som forbedrer kontrasten i plasma. | 633 | nd | 645-700 | 20 mg / Kg |
| Rhodamine R6 | Vital sonde som akkumuleres i aktive mitokondrier. Det etiketter endothelia og sirkulerende hvite cellene etter intravenøs injeksjon. | 561 | 800 | 570-650 | 25 mg / Kg |
| Fluospheres-1micron diameter | Perler som er uptaken av celler med fagocytisk aktivitet. | 488 | 800 | 500-540 | nd |
| Alexa488-merket fibrin IIβ kjede-spesifikt antistoff | Sonde som etiketter fibrin IIβ kjeden | 488 | 800 | 500-540 | 0,3 mg / kg |
Tabell 1. Fluoriserende prober for intravital mikroskopi. Vital fluorescerende fargestoffer med ulike lokaliseringer som kan brukes til å merke milten in vivo. Eksitasjon / utslipp (Eks / em) områdene skal brukes med én-foton (eller to-foton mikroskopi) er gitt. Dosen indikert er oppløst i 0,1 til 0,2 ml saltvann buffer og injisert til halen vein av musen. [Nd: ikke bestemt i denne studien.
Figur 1. Intravital mikroskopi av milten. A. Leica TCS-SP5 confocal mikroskop med en mus plassert på scenen av mikroskopet. Musen har mindreverdig del av milten eksponert og forseglet med en cover-slip. B. Bilde av et representativt område av milten av en ikke-infiserte dyr injisert med FITC-merket RBCs og70 kDa Dextran-Texas Red å visualisere blodkar. Reflection (gul), er Dextran (blå) og FITC-RBCs (grønn) vises. Blow-ups i hvite boksene representerer open-sirkulasjon (1) og close-sirkulasjon (2) områder. Open-sirkulasjon (C) og close-sirkulasjon (D) farget med 70 kDa dekstran (rød) og Hoechst 33342 (blå).
Figur 2. Kvantifisering av parasitt mobilitet og blodstrøm. AC. Kvantitativ analyse av partikkel bevegelse i fire dimensjoner (4D) er tilrettelagt med fargekodede bildebehandling. A. Sporing ble utført med dybdeinformasjon fra Z-kodet fargebilder, representert med maksimal intensitet projeksjon av fem forskjellige dybder. Hvit rektangel representerer den samme partikkel på ulike Z i ett tidspunkt. Ulike posisjoner skyldes tid bortfaller mellom oppkjøpetav forskjellige Z bilder. Dybde-kode:. Gul (0 mikrometer), orange (2 mikrometer), rosa (4 mikrometer), blå (6 mm), grønn (8 mikrometer) B, C. Tid projeksjoner av partikkel bevegelse med hvert tidsintervall farget som: grå (0 til 2,4 sek), cyan (2.4 til 4.8 sek), magenta (4,8 til 7,0 sek), rød (7,0 til 9,4 sek) og gult (09.04 til 11.08 sek). Hvit linje representerer 4D manuell sporing av partikler av 17x-(11,8 s) (B) og 17XL (4,8 sek) (C) GFP parasitter bruker MTrackJ. D, E. Fordeling av tettheten av GFP partikler av verdier av retningen (D) og oppholdstid (E). Data svarer til 120 partikler av hver linje av parasitter og 100 FITC-merket RBCs fra tre uavhengige eksperimenter analysert med likeverd-of-medianer test. Den 17X/17XL/FITC-RBCs medianer er 0.53/0.75/0.85 (D) og 4.61/0.67/0.9 sek (E). Forskjeller mellom de to linjene i
Movies 1 og 2. Time-lapse intravital mikroskopi bilder av murine milt infisert med 17XL (1) eller 17x (2) GFP-transgene parasitter ved 10% parasitemia (Z-maksimal projeksjon). Parasitt og vev autofluorescence er vist i grønt og rødt hhv. Scale søylene representerer 10 mikrometer og tidsintervallet er i sek.
v "> Klikk her for å se film 1.
Klikk her for å se Movie 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gjennomføringen av intravital mikroskopi av milten i dette gnager malaria Modellen åpnet muligheten for å undersøke dynamiske passasje av parasitter gjennom dette organet som hittil har vært ansett som en "black-box" på grunn av tekniske hensyn. Her ble det en stor innsats satt til å tilpasse seg en kvantitativ metode som tillater komparativ analyse av ulike parasitter linjer på singel og befolkningen nivåer. I motsetning til andre vev og celler som hadde blitt fotografert tidligere i malaria 3,5, må avbildning passasjen av pRBCs gjennom milten til å ta hensyn til tredimensjonalitet og compartmentalization av orgelet, tilstedeværelsen av forskjellige opplag med rask og langsom 13 flux, samt den raske erythrocyte hastigheter. Med dette målet, var en bestemt metodikk som bruker elektronisk tilgjengelig ImageJ programvare utviklet for å muliggjøre enkelt parasitt sporing, mobilitet analyse og sammenligning mellom linjene på population nivå. Imidlertid er anvendelsen av automatiske programvare som løser identifikasjon og sporing av enkelt parasitter i denne sammenheng fortsatt nødvendig. Av notatet, har parametre brukt for å beskrive parasitt mobilitet tidligere blitt beskrevet i andre studier å rapportere lymfocytt rekruttering og heft in vivo 12,14,15. Derfor bør denne metoden og parametre anses som et nytt verktøy til in vivo studier av etterlevelse i malaria. I fremtiden vil vi bruke denne teknologien til å få innsikt i immunobiology og parasitt-milten celle interaksjoner av tenkelig infeksjon i transgene mus som uttrykker fluorescerende reporter gener i ulike celler. Videre kan den generasjonen av transgene parasitter uttrykke fluorescerende markører annet enn GFP brukes i kombinasjon til bilde dual infeksjoner i denne modellen.
In vivo imaging er et kraftig verktøy for å studere det dynamiske samspillet mellom parasitter innenfor sine verter. Men det exist flere faktorer som påvirker celle mobilitet som må tas hensyn til. Endringer i vevet arkitekturen som svar på infeksjon med ulike Plasmodium stammer kan endre celle passasje og samspill med vevet 7,16 og reologiske egenskapene til røde blodlegemer, samt endringer i hematokrit eller andre hematologiske parametere, kan påvirke blodstrømmen og dermed samspillet av celler med vev. Av denne grunn anbefaler vi å analysere fartøy blodstrømmen med prosedyren som følger med. For å unngå konfunderende effekter, avbildes vi milt av infiserte mus på et tidspunkt da hematokrit, reticulocytemia og parasitt tropisme er sammenlignbar i begge infeksjoner 7.
Oppløsningen på denne teknikken gir mulighet for observasjon av enkelt fluorescerende celler som passerer gjennom milten på tidligere tidspunkter (<1% parasitemia). Imidlertid var kvantitativ analyse av dynamiske oppførsel av parasitter utførtved 1% parasitemia, var da tilstrekkelig antall pRBCs observert passerer gjennom milten ved tiden bortfaller som tillater sporing av encellede bevegelse. I filmer 1 og 2, som tilsvarer dyr ved 10% parasitemia, viste vi den generelle mønsteret av parasitt passasje gjennom milten i hver infeksjon, men var kvantitativ analyse av bevegelige celler utført i filmer fra dyr ved 1% parasitemia, hvor enkelt cellene er lett følges. Grunnet den raske tre-dimensjonal bevegelse av infiserte røde blodceller, kunne vi ikke skille mellom utviklingsstadier av parasitten, som ulike fluorescens intensiteter kunne tilskrives forskjellige dybder eller penetrability av laser.
Med denne fremgangsmåten, kan fluorescerende celler bli visualisert i subkapsulær sonen av milt, består hovedsakelig av røde fruktkjøttet 17. Ved å bruke plasma fargestoffer, kunne vi skjelne mellom raske / lukket og slow / åpne opplag av den røde fruktkjøttet. Andre studierhar rapportert avbildning av fluorescerende T-celler i det hvite fruktkjøttet med confocal 18 år eller to-foton mikroskopi 19, med den siste gir større vev penetrasjon. I disse er off-line analyser og ex vivo karakterisering av sonen blir fotografert en viktig faktor å nøyaktig tolke dataene. Dermed innsats for å opplyse de microcirculatory strukturen i milt, samt utvikling av sonder som etiketten spesifikke celler og strukturer, er av betydning å legge til rette studiet av parasitt-vert interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi er spesielt takknemlige for S. Graewe og V. Heussler for den innledende opplæring og kontinuerlig innspill i intravital mikroskopi av malaria parasitter, til J. Burns for å donere GFP transgene parasitter, til A. Bosch (confocal Unit, CCiT-UB, IDIBAPS) for bistand i bildeanalyse og kvantifisering og P. Astola for teknisk assistanse. Vi takker R. Tous og I. Caralt for videoproduksjon. MF er en mottaker av en utdannet fellesskap fra generalitet Catalonia. HAP er en ICREA forskning professor. Arbeidet i laboratoriet av HAP er finansiert av Det europeiske fellesskaps sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) under stipend avtale N ° 242 095, av private Foundation Cellex (Catalonia, Spania), og ved det spanske departementet for vitenskap og innovasjon ( SAF2009-07760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer Pharma GmbH | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. vander, R, A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. The complete spleen. , Totowa. Humana Press. (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
