Summary
Vi viser en metode til at udføre intravital mikroskopi af milten ved hjælp af GFP transgene malaria parasitter og kvantificering af parasitten mobilitet og blodgennemstrømningen inden for dette organ.
Abstract
Fremkomsten af intravital mikroskopi i eksperimentelle gnaver malaria modeller har gjort store fremskridt med viden om parasit-vært interaktioner 1,2. Således har in vivo imaging af malaria parasitter under pre-erythrocytkoncentrationen stadier afslørede aktive indgangen af parasitter ind i huden lymfeknuder 3, den fuldstændige udvikling af parasitten i huden 4, og dannelsen af en hepatocyt-afledt merosome at sikre migration og frigivelse af merozoites i blodet 5. Desuden har udviklingen af de enkelte parasitter i erytrocytter for nylig blevet dokumenteret ved hjælp af 4D billedbehandling og udfordrede vores nuværende syn på protein eksport i malaria 6. Således har intravital imaging radikalt ændret vores holdning til vigtige begivenheder i Plasmodium udvikling. Desværre, undersøgelser af de dynamiske passage af malaria parasitter gennem milten, en stor lymfoide organ udsøgt tilpasset for at rydde inficeret rød blood celler er mangler på grund af tekniske begrænsninger.
Brug af murine model af malaria Plasmodium yoelii i BALB / c mus, har vi implementeret intravital billeder af milt og rapporterede en differentieret ombygning af det, og overholdelse af parasitized røde blodlegemer (pRBCs) til barriere celler fibroblastic oprindelse i den røde pulpa under infektion med den ikke-dødelige parasit line P.yoelii 17x i modsætning til infektioner med P.yoelii 17XL dødelige parasit linje 7. For at nå disse konklusioner, blev for en specifik metode bruger ImageJ gratis software udviklet til at muliggøre karakterisering af de faste tre-dimensionelle bevægelse af single-pRBCs. Opnåede resultater med denne protokol tillader bestemmelse af hastighed, retning og opholdstid af parasitter i milten, alle parametre fat overholdelse in vivo. Hertil kommer, rapport vi metoden for blodgennemstrømningen kvantificering ved hjælp af intravital mikroskopi og brugen af DIFskellige farvestoffer at få indsigt i den komplekse mikrocirkulatoriske strukturen af milten.
Etik erklæring
Alle dyr blev udført på dyret faciliteter University of Barcelona i overensstemmelse med retningslinjer og protokoller, der er godkendt af den etiske komité for dyreforsøg fra University of Barcelona CEEA-UB (protokol nr. DMAH: 5429). Kvinde BALB / c mus af 6-8 ugers alderen blev indhentet fra Charles River Laboratories.
Protocol
Denne metode blev brugt i forskning, aflagde rapport i 7.
1. Animal infektion med grønt fluorescerende protein (GFP) transgene parasitter
- P. yoelii-GFP transgene linier 17XL og 17x blev genereret ved brug af samme vektorer, målrettet strategi og protokoller beskrevet andetsteds for P. berghei 8. De udtrykker det muterede 3 variant af GFP 9 under den allestedsnærværende promotor af P. berghei strækningsfaktor 1 (Pbeef1a), som dirigerer konstitutiv ekspression af GFP til at parasitten cytosolen under hele intra-erythrocytkoncentrationen udviklingsmæssige cyklus.
- Sprøjt dyr intraperitonealt med parasitized røde blodlegemer (pRBCs) af P. yoelii-GFP transgene linier 17XL og 17x indhentet fra halen blod fra donor mus på 5-10% parasitemia og fortyndes i PBS. Brug en dosis på 5x10 5 pRBCs / mus at nå frem til en perifer parasitemia på 1% på dag 3 post-infectipå (PI).
- På dag 3 pi, kontrollere, at parasitemia af mus inficeret med begge parasit linjer er det samme ved at lave en blodudstrygning med et fald på halen blod efterfulgt af Giemsa farvning og observation under et lysmikroskop med 100x olie mål. Parasitemia vurderes ved at beregne den procentdel af pRBCs på den samlede RBC i tre optiske felter på omkring 300 roede blodlegemer.
- Kontrol dyr injiceret med FITC-mærkede RBC kan bruges til at karakterisere bevægelsen af disse celler i normal milt.
2. Mærkning af røde blodlegemer med FITC og injektion til at styre dyrene
- Indsaml 1 ml af alt blod gennem hjertet punktering af et BALB / c mus i 200 μl af PBS indeholdende ethylen diamin tetra-acetat (EDTA) (100 g / l, pH 7,4) og vaske RBC pellet i PBS / EDTA (0,1 g / L, pH 7,4) ved centrifugering ved 300 xgi 5 minutter (min) ved stuetemperatur (RT).
- Resuspender 200 μl af RBC pellet i 300 &MU, l PBS / EDTA (0,1 g / L, pH 8) indeholdende FITC (10 g / L), og der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur i mørke med rolige bevægelser. Efter den tid, er supernatanten fjernes, og cellerne vaskes fem gange (300 xg 5 min, RT) i PBS / EDTA (0,1 g / l, pH 7,4).
- For in vivo eksperimenter, fortyndes 10 μl af den FITC-mærkede RBC pellet i 200 μl af PBS og injiceres intravenøst til en BALB / c mus med henblik på at nå op på 1% FITC-RBC i omløb.
3. Kirurgiske indgreb
- Forbered injicerbar bedøvelsesmiddel, der består af 100 mg / kg Ketamin og 5 mg / kg midazolam per dosis i henhold til vægten af dyret. Injicere musen intraperitonealt med en dosis af bedøvelsesmiddel. Readminister halvdelen af den dosis hver 30 min for at bevare musen fuld tid bedøvede.
- Hold musen varm og kontrollere, at musen er helt bedøvet (normalt efter 5-20 min) ved at klemme foden pad, før du fortsætter.
- Med henblik på atlette intravenøs indgift af stoffer i løbet af forsøget, cannulate halen vene af musen med en 27G kanyle. Kontrollér, at nålen er godt placeret inde i venen ved at injicere 20-50 μl af saltvand buffer og forsegle det med tape. Hvis det hindrer, gentag kanylering opstrøms af venen. Vær forsigtig med ikke at indføre luftbobler.
- Expose den ringere del af milten gennem et lille snit i huden og muskulaturen i venstre dorsale side af dyret. Placer milten, hvor mindre ånde bevægelse er observeret og anvende PBS på den overflade, der udsættes for at holde den ren med musen hår og hydreret.
- Seal et cover-slip af 60x24mm med cyanoacrylat lim (Super lim-3 Loctite) til huden omkring milten til at tillade visualisering.
4. Imaging af levende parasitter i milten
- Intravital mikroskopi eksperimenter blev udført i et Leica TCS-SP5 konfokal mikroskop (LeicaMikrosystemer, Heidelberg, Tyskland) er udstyret med en inkubation system med temperaturkontrol, en APO 63x glycerol fordybelse objektiv (NA 1,3), resonant scanner ved 8000 linier / s og en Argon (488 nm) og HeNe (594 nm, 633 nm) lasere. Yderligere lasere, såsom blå diode (405 nm) og diode-pumpe-solid state (561 nm), kan være nødvendig for excitation af sonder, der er anført i tabel 1.
- Placer dyret på scenen af mikroskopet med cover-gled milt nedad til målet. Et overblik over de mikrocirkulatoriske strukturen af milten kan valgfrit visualiseres ved hjælp af et 20x objektiv. RBC refleksion kontrast vil være nyttigt at vælge forskellige områder af interesse for billede ved højere forstørrelse bagefter.
- Fokus på udvalgte regioner af interesse med 63x glycerol nedsænkning objektiv ved hjælp af væv autofluorescens. GFP parasitter er observeret gennem forskellige områder af milten.
- Fluorescens er indspillet på to forskellige channels (excitation / emission bølgelængde 488/505-580 nm til FITC / GFP og 488/570-630 nm for vævs autofluorescens) med pinhole indstillet til 3,0 Airy enheder. RBC refleksion (488/480-495 nm), sammen med fluorescerende farvestoffer til at mærke blodet kar (se tabel 1), bruges til at indhente yderligere oplysninger om den zone, der filmede og i blodgennemstrømningen eksperimenter beskrevet nedenfor.
- Tag billeder gennem fem Z-stakke, der dækker en dybde på 8 μm på grund af de tre dimensioner af organet, med en hastighed på 8 kHz for at generere videoer på 1,5 min.
- Optag videoer af forskellige zoner af milten til kvantitativ analyse.
5. Intravital mikroskopi af microvasculature af milten og image erhvervelse af blod flowmåling
- Vital fluorescerende prober opløst i isotonisk saltvand kan injiceres til halen vene under eksperimentet til billede vaskulaturen og få indsigt i strukturen af milten. En listeaf sonder og deres anvendelse fremgår af tabel 1 10.
- At mærke det vaskulære system med fluorescerende dextran, forberede 1 mg af 70 kDa dextran mærket med Texas Red i 100 μl af saltvand buffer.
- Brug kanylerede hale vene at injicere fluorescerende dextran til dyret, der filmede.
- Indstil skibe vandret, i retning af laserscanning af optiske felt rotation (ikke påvirker hastighed). Brug xy og XT linje scanningstilstande i den centrale lumen af fartøjet. Brug tovejs scanning med en linje gennemsnitligt 32 med en hastighed på 8 kHz for at få et billede på 512x512 pixels.
- Anskaf billeder af fartøjer på tre forskellige kanaler (excitation / emission bølgelængde 488/505-580 nm, 594/605-660 nm, 488/480-495 nm for FITC / GFP, dextran-Texas Red og erythrocyt refleksion, henholdsvis).
- Tag billeder af skibe med forskellige diametre og over forskellige faser af hjertets cyklus for at kompensere for udsving. I disse billeder, vil de striber, der følger af at flytte celler anvendes til at kvantificere blodgennemstrømning 11.
6. Billedbehandling og kvantitativ analyse af parasitten mobilitet ved hjælp af ImageJ software
- Opret en real-time video fra billedet sekvensen genereres ved hjælp af ImageJ software (version 1.39o, Wayne Rasband, NIH, www.macbiophotonics.ca ).
- Åbn ". LIF"-fil i ImageJ holde "xyzct" sekvens og adskilte kanaler.
- Tilmeld dig nogle nyttige oplysninger fra metadata filen: dblvoxelX-voxel-bredde, dblvoxelY-voxel-højde, dblvoxelZ-voxel-dybde og frame interval mellem de efterfølgende Z-rammer og mellem stakke. Denne information vil blive brugt til kalibrering.
- Træk autofluorescens (kanal 2) til den GFP-parasitten billeder (kanal 1). Filtrer billeder med Gaussian Blur = 1. Vær opmærksom på, at ved hjælp af Gaussisk sløring filter i billeder skal angives til publications. Gem filen "animal1_m1_substract.seq".
- En Z-kodet farvevideokort er skabt som støttende materiale til kvantitativ analyse af parasitten mobilitet, da det vil lette enkelt-partikel identifikation i hurtige partikler og Z-bevægelse karakterisering.
- Konverter stakken til Billed 5D, med tredje dimension er den Z og fjerde dimension som den tid. Giv en anden farve til hver Z og overlay.
- Projekt alle Z med maksimal intensitet i løbet af hele tiden rammer for at skabe en Z-kodet farve video. Gem som "animal1_m1_Z_color.avi".
- Klassificere og mærke alle de partikler, der vises i de første 10 tidsrammerne af videoen i forhold til antallet af frames bopæl (fra 1 til 10). I hver video, vil 20 partikler blive sporet efter de opnåede proportioner. I alt vil 120 parasitter blive kvantificeret fra 3 dyr, med seks videoer / dyr, der repræsenterer forskellige områder af milten.
- Rapport for rammerne af bolig på hver Zog over hele filmen for alle de partikler, der skal kvantificeres.
- Udfør 4D (x, y, z, t) manuel sporing af partikler ved hjælp af MTrackJ plugin (skrevet af E. Meijering). Åbn filen "animal1_m1_substract.seq" som billede 5D og sæt billedet egenskaber ved hjælp af de registrerede oplysninger før fra pixel bredde, højde, dybde (i μm) og stak interval (i sek). Konfigurer sporet indstillingerne som følger: "Flyt til næste gang" og "anvende lokale cursor-lyse centroid/25x25pixel". Konfigurer visning: "show oprindelse", "Vis billede", "vise aktive spor", "Vis kun spor i de nuværende kanaler", "Vis kun sporpunkt på nuværende tidspunkt".
- Tilføj et spor for hver partikel. Overvej bevægelse i Z-aksen, hvis fordrivelse er højere end 6 m (gennemsnitlig diameter for en pRBC). Følg partikel over et maksimum på 100 billeder.
- Gem x, y, z og t koordinater målt fra banen som "animal1_m1_p1". Xls.
- Foranstaltninger for deplacement (D = sqrt ((x endeligt-X inital) 2 + (y endelige-y inital) 2 + (z sidste-z inital) 2), vejlængde (P = Σ n = 0 → endelige SQRT ((x n + 1-x n) 2 + ( y n +1-y n) 2 + (z n +1-z n) 2) med n angiver hver position spores: gennemsnitlig hastighed, og opholdstiden kan beregnes ved hjælp af værdierne fra x, y, z, t koordinater sporet kalibreret henhold til de registrerede data. Direktionalitet af partiklerne er defineret som kvotienten af forskydningen vs lysvej, med værdier for tæt på 1 angiver rettet bevægelse og værdier tæt på 0 indikerer behersket bevægelse 12. En skabelon til beregninger lettes lukket.
7. Beregning af volumetriske blodgennemstrømning
- Volumetrisk blodgennemstrømningen anslås som Q = V * π * D mod 2 / 4, med V, erytrocyt hastighed over tværsnittet ennd D mod, lumen fartøj diameter på 11.
- For at beregne V, måle vinkler (θ) af fem partikel striber viser lyse refleksion (RBC) og fire partikel striber viser grøn fluorescens (pRBC-GFP) i hvert xt billedet ved hjælp ImageJ software. Mål lumen fartøj diameter på XY billedet.
- Den hastighed er så udtrykt som V = 1/tan (θ) * D e / D mod at normalisere for erytrocyt (D e = 6 μm) og lumen fartøj diametre.
- Kvantificere mindst tre fartøjer med forskellige diametre og fem XT billeder for hvert fartøj.
8. Statistisk analyse
- Til statistisk analyse, plot retningsvirkning, betyder hastighed og opholdstid tæthed udlodninger og bruge lige-of-medianer test i STATA (IC10) at vurdere forskellene mellem de to parasit linjer.
9. Repræsentative resultater
Intravital imaging af GFP parasitter i milten afslørede forskelle i mobiliteten mellem de to stammer af parasitter. Kvantitativ analyse af mobilitet parametre enkelt parasitter angivet reduceret hastighed, manglende direktionalitet og augmented opholdstid af parasitter af mus inficeret med 17x stamme. Endvidere blev volumetrisk blodgennemstrømningen i fartøjer, der ikke ændres mellem stammer 7. Den tekniske procedure er præsenteret i figur 1A. Figur 1b viser et generelt billede af en normal milt fra en mus injiceret med FITC-mærkede røde blodlegemer, med et zoome ind i den røde pulpa og en anden til et fartøj (Figur 1B, zoom i 1 og 2, henholdsvis). Vaskulatur blev dokumenteret ved at injicere 70 kDa Dextran-Texas Red sammen med erytrocyt refleksion kontrast. Andre fluorescerende farvestoffer opsummeret i tabel 1 kan bruges til at få oplysninger om orglet, der filmede, som Hoechst (figur 1C, 1D).
Real-time scanning af parasitter af 17XL og 17x stamme er præsenteret i film 1 og 2,med nogle 17x-pRBC (Movie 2) viser en rullende cirkel adfærd. Kvantitativ analyse af mobilitet parametre blev opnået gennem sporing af de enkelte parasitter ved hjælp af Z-kodet farvebilleder. Figur 2A viser en Z-projektion af en Z-kodet farve stack, hvor de omringede partikel vises bevæge sig i forskellige planer. Figur 2B og 2C repræsenterer sporene til forskellige parasitter i 17x og 17XL infektion, hhv. Resultater fra direktionalitet og opholdstid for alle de kvantificerede partikler præsenteres som en tæthed fordeling kort over parasit befolkningen i figur 2D og 2E, hhv. For at overvåge blodgennemstrømningen i milten ved hjælp intravital mikroskopi, var de striber opnået i XT billeder af den centrale lumen af fartøjer, der følger af erythrocyt bevægelsen målt til at beregne hastighed 11. Billederne viser et xy-scanning af et fartøj (Figur 2F) med de tilsvarende XT linje scanning (Figur 2G).
| Fluorescerende Probe | Lokalisering | 1 foton Excitation (nm) | 2 foton Excitation (nm) | Opdagede emission (nm) | Mængde / mus vægt |
| Hoechst 33342 | Membran-permeant DNA-bindende sonde. Det etiketter kerner af alle celler (levende og døde) efter intravenøs injektion. | 405 | 800 | 410-480 | 12,5 g / kg |
| Propidium iodid | Membran-impermeant DNA-bindende sonde. Det mærker kerner af celler med kompromitterede membran (apoptotic og nekrotisk celler). | 561 | 800 | 570-650 | 250 mg / kg |
| 70.000 mol WT Dextran-fluorescerende (FITC, Texas Red) | Fluid-fase markør, der øger kontrasten af plasma. | FITC 488 Texas Red 594 | 800 | 500-540 600-650 | 50 mg / kg |
| Natrium Fluorescein | Bulk fluid-fase albumin markør, der øger kontrasten af plasma. | 488 | 800 | 500-540 | 2 mmol / kg |
| Evans Blå | Bulk fluid-fase albumin markør, der øger kontrasten af plasma. | 633 | nd | 645-700 | 20 mg / kg |
| Rhodamine R6 | Vital sonde, der ophobes i aktiv mitokondrier. Det etiketter endothelia og cirkulerende hvide blodlegemer efter intravenøs injektion. | 561 | 800 | 570-650 | 25 mg / kg |
| Fluospheres-1micron diameter | Perler, der er uptaken af celler med fagocyterende aktivitet. | 488 | 800 | 500-540 | nd |
| Alexa488-mærket fibrin IIβ kæde-specifikke antistof | Probe, at etiketterne fibrin IIβ kæde | 488 | 800 | 500-540 | 0,3 mg / kg |
Tabel 1. Fluorescerende prober for intravital mikroskopi. Vital fluorescerende farvestoffer med forskellige lokaliseringer, der kan anvendes til mærkning af milten in vivo. Excitation / emission (Exc / em) varierer til brug sammen med én-foton (eller to-foton mikroskopi) er forudsat. Den angivne dosis er opløst i 0,1-0,2 ml saltvand buffer og injiceres til halen vene af musen. [Nd: ikke bestemt i denne undersøgelse.
Figur 1. Intravital mikroskopi af milten. A. Leica TCS-SP5 konfokal mikroskop med en mus placeret på scenen af mikroskopet. Musen har den ringere del af milten udsatte og forseglet med et cover-slip. B. Billede af et repræsentativt område af milten af en ikke-inficerede dyr injiceret med FITC-mærkede røde blodlegemer og70 kDa Dextran-Texas Red at visualisere kar. Reflection (gul), er Dextran (blå) og FITC-RBC (grøn) vist. Blow-ups i hvide bokse repræsenterer open-omløb (1) og close-omløb (2) områder. Open-cirkulation (C) og close-cirkulation (D) farvet med 70 kDa dextran (rød) og Hoechst 33342 (blå).
Figur 2. Kvantificering af parasitten mobilitet og blodgennemstrømningen. AC. Kvantitativ analyse af partikels bevægelse i de fire dimensioner (4D) er lettes ved hjælp af farvekodede billedbehandling. A. Sporing blev udført med den dybde oplysninger fra Z-kodede farvebilleder, repræsenteret ved hjælp af maksimal intensitet fremskrivning af fem forskellige dybder. Hvid rektangel repræsenterer den samme partikel på forskellige Z i ét tidspunkt. Forskellige positioner skyldes tid bortfalder mellem erhvervelsenaf forskellige Z billeder. Dybde-kode:. Gul (0 μm), orange (2 μm), pink (4 μm), blå (6 μm), grøn (8 μm), B, C. Tid fremskrivninger af partiklens bevægelse med hvert tidsinterval farvet som: grå (0-2,4 sek), cyan (2,4-4,8 sek), magenta (4,8-7,0 sek), rød (7,0-9,4 sek) og gul (9,4 til 11,8 sek). Hvid linje repræsenterer 4D manuel sporing af partikler af 17x (11,8 s) (B) og 17XL (4,8 sek) (C) GFP parasitter ved hjælp af MTrackJ. D, E. Fordeling af tætheden af GFP partikler ved værdierne af direktionalitet (D) og opholdstid (E). Data svarer til 120 partikler af hver linje af parasitter og 100 FITC-mærkede RBC fra tre uafhængige forsøg analyseret med ligestillings-of-medianer test. De 17X/17XL/FITC-RBCs medianer er 0.53/0.75/0.85 (D) og 4.61/0.67/0.9 sec (E). Forskelle mellem de to linjer i
Film 1 og 2. Time-lapse intravital mikroskopi billeder af murine milten inficeret med 17XL (1) eller 17x (2) GFP-transgene parasitter på 10% parasitemia (Z-maksimum projektion). Parasitten og væv autofluorescens er vist i grøn og rød hhv. Skala søjler repræsenterer 10 ìm og tidsintervallet er i sek.
v "> Klik her for at se Movie 1.
Klik her for at se Movie 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gennemførelsen af intravital mikroskopi af milten i denne gnaver malaria model åbnet mulighed for at undersøge den dynamiske passage af parasitter gennem dette organ, som indtil nu har været betragtet som en "black-box" på grund af tekniske overvejelser. Herinde blev en stor indsats sat til at tilpasse en kvantitativ metode, der giver mulighed for sammenlignende analyser af forskellige parasit linjer på enkelt og befolkning niveauer. I modsætning til andre væv og celler, der var blevet afbildet før i malaria 3,5, har brug for billedbehandling passagen af pRBCs gennem milten at tage hensyn til de tre dimensioner og opdeling af orglet, tilstedeværelsen af forskellige oplag med hurtige og langsomme flux 13, samt den hurtige erytrocyt hastigheder. Med dette mål, var en bestemt metode ved hjælp af tilgængelige online ImageJ software udviklet til at gøre det muligt for en enkelt parasit sporing, mobilitet analyse og sammenligning mellem linjerne på populatioN-niveau. Imidlertid er anvendelsen af automatiske software, der løser identifikation og sporing af enkelte parasitter i denne sammenhæng stadig behov for. Af note, har de parametre, der anvendes til at beskrive parasitten mobilitet tidligere blevet beskrevet i andre undersøgelser til at rapportere lymfocyt rekruttering og vedhæftning in vivo 12,14,15. Derfor bør denne metode og parametre betragtes som et nyt værktøj til at in vivo studier af overholdelsen i malaria. I fremtiden vil vi bruge denne teknologi til at få indsigt i immunobiology og parasit-milt celle interaktioner af imaging-infektion hos transgene mus udtrykke fluorescerende reporter gener i forskellige celler. Desuden kan den generation af transgene parasitter udtrykke fluorescerende markører, bortset GFP anvendes i kombination til billede dobbelte infektioner i denne model.
In vivo imaging er et kraftfuldt værktøj til at studere dynamiske samspil af parasitter inden for deres værter. Men der exist flere faktorer, der påvirker celle mobilitet, der skal tages i betragtning. Ændringer i vævet arkitekturen som reaktion på infektion med forskellige Plasmodium stammer kan ændre cellekulturpassage og samspil med vævet 7,16 og rheologiske egenskaber af røde blodlegemer, samt ændringer i hæmatokrit eller andre hæmatologiske parametre, kan påvirke blodgennemstrømningen og dermed samspillet mellem celler med vævet. Af denne grund anbefaler vi at analysere fartøj blodgennemstrømning med den procedure. For at undgå forstyrrende effekter, vi afbildet milten af inficerede mus på et tidspunkt, hvor hæmatokrit, reticulocytemia og parasit tropisme er sammenlignelig i begge infektioner 7.
Løsningen af denne teknik giver mulighed for observation af en enkelt fluorescerende celler gennem milten på tidligere tidspunkter (<1% parasitemia). Der blev dog kvantitativ analyse af de dynamiske opførsel af parasitter udførespå 1% parasitemia, var, da et tilstrækkeligt antal pRBCs observeret gennem milten på tidspunkt bortfalder, der tillader sporing af enkelt celle bevægelse. I film 1 og 2, hvilket svarer til dyr på 10% parasitemia, viste vi det generelle mønster for parasitten passagen gennem milten i hver infektion, dog var kvantitativ analyse af flytte celler udføres i film fra dyr på 1% parasitemia, hvor enkelt celler er nemt følges. På grund af den hurtige tre-dimensionelle bevægelse af inficerede røde blodlegemer, kunne vi ikke skelne mellem udviklingsmæssige stadier af parasitten, som forskellige fluorescens intensiteter kunne tilskrives forskellige dybder eller gennemslagskraft af laseren.
Med denne procedure kan fluorescerende celler kan visualiseres i subkapsulær zone af milt, sammensat primært af røde papirmasse 17. Ved at bruge plasma-farvestoffer, kunne vi skelne mellem hurtige / lukket og langsom / åbne oplag af den røde papirmasse. Andre undersøgelserhar rapporteret billeder af fluorescerende T-celler i den hvide papirmasse ved hjælp af konfokal 18 eller to-foton mikroskopi 19, med den sidste, der tilbyder større væv penetration. I disse, er off-line analyse og ex vivo karakterisering af den zone, der filmede en vigtig faktor præcist at fortolke data. Således er indsatsen for at oplyse mikrocirkulatoriske strukturen af milten, samt udvikling af sonder, at etiketten specifikke celler og strukturer, der er af betydning for at lette undersøgelsen af parasit-værts interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi er især taknemmelige for S. Graewe og V. Heussler for grunduddannelse og løbende input i intravital mikroskopi af malaria parasitter, til J. Burns for at donere GFP transgen parasitter, til A. Bosch (Konfokal Unit, det går stærkt ind-UB, IDIBAPS) for at få hjælp i billede analyse og kvantificering og P. Astola til teknisk bistand. Vi takker R. Tous og I. Caralt til videoproduktion. MF er en modtager af en kandidat stipendium fra den generelle betydning af Catalonien. HAP er en ICREA forskningsprofessor. Arbejde i laboratoriet af HAP er finansieret af Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale nr. 242095, af den selvejende institution Cellex (Catalonien, Spanien), og ved det spanske ministerium for videnskab og innovation ( SAF2009-07760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer Pharma GmbH | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. vander, R, A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. The complete spleen. , Totowa. Humana Press. (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
