Summary

A Unidade Funcional Motor na placa de cultura: Co-cultivo de explantes da Medula Espinhal e as células musculares

Published: April 12, 2012
doi:

Summary

Células musculares cultivadas são um modelo inadequado para recapitular músculo inervado<em> In vivo</em>. Uma unidade de motor funcional pode ser reproduzida<em> In vitro</em> Por inervação diferenciados humanos células musculares de ratos embrionários primários usando explantes da medula espinhal. Este artigo descreve como co-culturas de explantes da espinal medula e células musculares são estabelecidos.

Abstract

Humanos células musculares primárias cultivadas em monocamada aneurally raramente contrato espontaneamente, porque, na ausência de um componente do nervo, diferenciação celular é limitada e motor estimulação neuronal está ausente 1. Estas limitações dificultar o estudo in vitro de muitas doenças neuromusculares em células musculares em cultura. Importante, as restrições experimentais de monolayered, células musculares em cultura pode ser superado pela inervação funcional de miofibras com explantes da medula espinal em co-cultura.

Aqui, nós mostram os diferentes passos necessários para atingir um inervação, eficiente adequado de células musculares humanos primários, levando à completa contracção diferenciação e de fibras de acordo com o método desenvolvido por Askanas 2. Para fazer isso, as células musculares são co-cultivadas com explantes espinal medula de embriões de ratos em ED 13,5, com o gânglio da raiz dorsal ainda ligado às fatias de medula espinhal. Depois de alguns dias, o músculo fibros começar a contrato e, eventualmente, tornar-se cruz-estriado através inervação por neurites funcionais projetando a partir dos explantes da medula espinhal que ligam para as células musculares. Esta estrutura pode ser mantida durante vários meses, simplesmente por troca regular do meio de cultura.

As aplicações desta ferramenta de valor inestimável são numerosas, pois representa um modelo funcional para análises multidisciplinares de desenvolvimento muscular humana e inervação. Na verdade, uma completa de novo instalação junção neuromuscular ocorre em um prato de cultura, permitindo uma fácil medição de muitos parâmetros em cada passo, num contexto fundamental e fisiológico.

Só para citar alguns exemplos, genômicos e / ou estudos de proteômica pode ser realizada diretamente sobre as co-culturas. Além disso, os efeitos pré e pós-sináptica pode ser e especificamente avaliados separadamente na junção neuromuscular, porque ambos os componentes vêm de diferentes espécies,de rato e humano, respectivamente. O nervo músculo-co-cultura pode também ser realizada com células musculares humanas isoladas de pacientes que sofrem de músculo ou doenças neuromusculares 3, e assim pode ser usado como uma ferramenta de rastreio de drogas candidatas. Finalmente, nenhum equipamento especial, mas uma instalação de BSL2 regular é necessária para reproduzir uma unidade de motor funcional em um prato de cultura. Este método, assim, é valiosa para ambos o músculo, bem como as comunidades de investigação neuromusculares para estudos fisiológicos e mecanicista da função neuromuscular, num contexto normal e doença.

Protocol

1. Preparação da cultura de células humanas muscular primária Estabelecer as culturas de células humanas musculares de acordo com a técnica de explante-re explante-4. Primeiro, remova não-tecido muscular das biópsias. Em seguida, incorporar 1 mm 3 explantes musculares em um coágulo de plasma, que permite que os fibroblastos de emergir dos explantes. Os explantes incorporados são transferidos para um prato de plasma gelatina revestido e deixá-los crescer em meio de cr…

Discussion

Uma ferramenta fisiológica in vitro para estudar a função da célula muscular em contexto normal e patológico é do maior interesse para os myologists, porque as culturas de células musculares geralmente não recapitular a importância de várias células e células do tipo conexões. A adição de neurónios motores purificado para as células musculares não é suficiente para alcançar uma unidade de motor funcional uma vez que a presença de células de Schwann é necessária para a inervação para se…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nosso trabalho é apoiado pela National Science Foundation suíço (SNF), a Iniciativa Suíça em Biologia de Sistemas (SystemsX.ch), a Muscular Dystrophy Association EUA (MDA), a Associação Française contre les Miopatias (AFM), o United mitocondrial Doença Fundação (UMDF), a Gebert-Ruf Fundação Programa das Doenças Raras (GRF), a Sociedade Suíça de Investigação das doenças musculares (SSEM / FSRMM), a Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Forschung medizinische", a Roche Research Foundation e da Universidade de Basileia.

Materials

Name of reagent Company Catalog Number
HBSS Gibco/Invitrogen 14170
MEM Gibco/Invitrogen 31095
Medium 199 Gibco/Invitrogen 31153
Fetal Bovine Serum Fetal Clone Perbio SH30066.03
Insuline Sigma I9278
Human EGF Sigma E9644
Human FGF Sigma F0291
Penicillin/streptomycin solution Gibco 15140

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Cite This Article
Arnold, A., Christe, M., Handschin, C. A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells. J. Vis. Exp. (62), e3616, doi:10.3791/3616 (2012).

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