Per condurre una rapida valutazione della funzione dei geni nello sviluppo della corteccia cerebrale, si descrivono i metodi che comportano l'<em> Ex vivo</emElettroporazione> plasmidi di co-espressione inibitoria RNA (RNAi) e GFP in murino corteccia embrionale. Questo protocollo è suscettibile allo studio dei vari aspetti della sviluppo neurologico, quali la neurogenesi, la migrazione neuronale e la morfogenesi neuronale compresi dendrite e l'estensione assonale.
La corteccia cerebrale dirige funzioni cognitive superiori. Questa sei struttura a strati è generata in un dentro-prima, fuori-ultimo modo, in cui i neuroni primi nati rimanere più vicino al ventricolo, mentre gli ultimi neuroni nati migrare passato i primi neuroni nati verso la superficie del cervello 1. Oltre alla migrazione neuronale 2, un processo chiave per la normale funzione corticale è la regolazione della morfogenesi neuronale 3. Mentre morfogenesi neuronale può essere studiato in vitro in colture primarie, c'è molto da imparare dal modo in cui questi processi sono regolati in ambienti tessuti.
Descriviamo le tecniche per analizzare la migrazione neuronale e / o morfogenesi in fette organotipiche della corteccia cerebrale 4,6. Un vettore pSilencer modificato viene utilizzato, che contiene sia un promotore U6 che guida l'RNA a doppio filamento tornanti e una cassetta di espressione separato che codifica la proteina GFP guidato bya CMV promoter 7-9. Il nostro approccio consente per la valutazione rapida dei difetti nella crescita dei neuriti su knockdown specifico di geni candidati ed è stato utilizzato con successo in uno schermo per i regolatori di crescita dei neuriti 8. Poiché soltanto un sottoinsieme di cellule esprimono i costrutti RNAi, le fette organotipiche permettere un'analisi mosaico dei fenotipi potenziali. Inoltre, poiché questa analisi è fatta in approssimazione nei pressi del ambiente in vivo, si fornisce un basso costo e rapida alternativa alla generazione di animali transgenici o knockout per geni di funzione sconosciuta corticale. Infine, in confronto con la tecnologia di elettroporazione in vivo, il successo di esperimenti ex vivo elettroporazione non dipende sviluppo abile capacità chirurgico e può essere eseguita con un tempo più breve di formazione e di abilità.
Questi metodi che comportano l'elettroporazione ex vivo di plasmidi che codificano RNA a doppio filamento tornanti 8 e cultura della organotipiche 4 fette di fornire diversi vantaggi. In primo luogo, questi metodi consentono una rapida valutazione di RNAi derivati fenotipi. L'inclusione di una codifica GFP cassetta di espressione nel vettore pSilencer stesso che contiene il promotore U6 che guida la forcina RNA a doppio filamento consente una rapida identificazione e caratter…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dott. Shirin Bonni per la fornitura del pSil-GFP costrutto, Dr. Alper Uzun per l'illustrazione della figura 1, e la struttura Bioimmagini Leduc per la microscopia confocale. EMM è sostenuta dal Premio alla Carriera per la scienza medica dalla Burroughs Wellcome Fund, un NARSAD Premio Giovani Ricercatori e NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01. SBL è supportato dal NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01, ed ha ricevuto il sostegno PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
Fast Green | SIGMA | F7252 | |
Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |