Summary
Om een snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen waarbij
Abstract
De cerebrale cortex leidt hogere cognitieve functies. Deze zes gelaagde structuur wordt gegenereerd in een in-first buiten-last wijze, waarbij de eerste geboren neuronen dichter blijven de hartkamer en de laatste geboren neuronen migreren voorbij de eerste geboren neuronen naar het oppervlak van de hersenen 1. Naast de neuronale migratie 2, een belangrijke proces voor normale corticale functie is de regulering van de neuronale morfogenese 3. Terwijl neuronale morfogenese bestudeerd kan worden in vitro in primaire culturen, is er veel te leren van de manier waarop deze processen worden geregeld in weefsel omgevingen.
We beschrijven technieken om neuronale migratie en / of morfogenese in organotypische plakken van de cerebrale cortex 4,6 analyseren. Een pSilencer gewijzigd vector wordt gebruikt die zowel een U6 promotor die de dubbelstrengs RNA haarspeld rijdt en een aparte expressiecassette dat GFP-eiwit codeert gedreven bya CMV promoter 7-9. Onze aanpak maakt het mogelijk voor de snelle beoordeling van de gebreken in neurietuitgroei op specifieke knockdown van kandidaat-genen en is met succes gebruikt in een scherm voor regulatoren van neurietuitgroei 8. Omdat er slechts een subset van cellen drukken de RNAi constructen, de organotypische plakjes zorgen voor een mozaïek analyse van de mogelijke fenotypes. Bovendien, omdat deze analyse wordt uitgevoerd in een bij aanpassing van de in vivo milieu, het een goedkope en snelle alternatief voor het genereren van transgene of knockout dieren genen bekend corticale functie. Tot slot, in vergelijking met de in vivo elektroporatie technologie, het succes van ex vivo elektroporatie experimenten is niet afhankelijk van bekwaam een operatie ontwikkeling van vaardigheden en kunnen worden uitgevoerd met een kortere trainingstijd en vaardigheid.
Protocol
1. Voorbereiden van Cultuur en Media Solutions (niet in video)
- Bereid 1 liter gebalanceerde zoutoplossing volledige Hank's (HBSS) met 1 x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH 7,4), 30 mM D-glucose, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4 en 4 mM NaHCO 3. Voeg dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O). Filter sterilisatie met een 0,2 pm filter en bewaren bij 4 ° C.
- Bereid slice kweekmedium met 35 ml van basismedium Eagle medium, 12,9 ml compleet HBSS, 20 mM D-glucose (1,35 ml 1 M oplossing), 1 mM Glutamax (0,25 ml van een 200 mM oplossing), 0,5 ml penicilline -streptomycine 100x voorraad. Filter sterilisatie met een 0,2 pm filter, voeg vervolgens hitte-geïnactiveerd paardenserum tot een eindconcentratie van 5%.
- Bereid Laminine werkoplossing door een 1 mg / ml voorraadoplossing Laminine met steriel gedestilleerd gedeïoniseerd water. Bereid 100 ul fracties in 0,5 ml Eppendorf buizen en bevriezen bij -80 ° C.
- Dus bereid Poly-L-lysine werkenlutie door toevoeging van 5 ml steriel H2O op 5 mg van poly-L-lysine een 1 mg / ml voorraadoplossing maken. Bereid 1 ml porties en invriezen bij -20 ° C.
- Bereid coating oplossing 1 ml poly-L-lysine en 100 ul van laminine tot een eindvolume van 12 ml met steriel water. Maak deze oplossing vers per keer.
2. Voorbereiden organotypische Slice Inserts (niet in video)
- Bereid twee zes-well platen met een cultuur insert per putje met behulp van een steriel pincet. Voeg 2 ml steriele DDH 2 O onder de cultuur van inserts.
- Voeg 1 ml van de bekledingsoplossing boven het membraan te vermijden dat te doorboren het membraan. Incubeer overnacht in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verwijder de coating media en was membraan met steriele H 2 0 drie keer. Laat inserts drogen voor gebruik. Voeg 1,8 ml van het kweekmedium slice en doe dit in 37 ° C incubator. Wikkel de ongebruikte platen met Parafilmen bewaren bij 4 ° C gedurende 4 weken.
3. Voorbereidingen voor Elektroporatie (niet in video)
- Bereid RNAi constructen voor elektroporatie. Dubbele streng RNA haarspeld inserts werden gekloneerd in een pSilencer vector. Het plasmide bevat: 1) een promotor die U6 de dubbelstrengs RNA productie aandrijft en 2) een GFP expressie cassette aangedreven door de CMV promoter 8,9. Dit plasmide werd eerder beschreven door Konishi en collega 9 en anderen 7,8. Plasmiden worden gezuiverd met behulp van een Qiagen maxi-prep kit en gebruikt bij een concentratie van 1 mg / mL.
- Om DNA visualiseren tijdens het injecteren te bereiden met 0,5% snelle groene kleurstof oplossing en het op 1:20 met het DNA te injecteren (meestal 20 pi DNA met 1 pl snel groen). Overblijft DNA snelle groene kleurstof mengsel worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende een week.
- Schoon dissectie gebied, dissecting gereedschappen en vibratome schip met 70% ethanol. Koel volledige HBSS zodat het ijskoud. Chill vibratome schip door inpakken ijs rond het binnen de vibratome met wat water voor een snelle koeling. Bereid 3% laag smeltpunt agarose met complete HBSS. Magnetron voor 1 min. Vermijd koken. Bewaar ze in een 42 ° C waterbad tot gebruik.
- Elektroporatie parameters worden ingesteld als volgt. Voor een E15 embryo gebruik 35 V, 5 pulsen, 100 ms lang, 900 ms interval tussen de pulsen. Voor oudere dieren, elektroporatie zorgen gebruik hogere spanning tot 50 V het aantal pulsen tot 8 pulsen. Om te voorkomen dat het weefsel in jonge dieren, gebruikt men minder pulsen of tot 2 pulsen en lagere spanning tot 25 V. Deze parameters kunnen worden gevarieerd en bepaald empirisch afhankelijk van de leeftijd van het dier.
4. Dissection en elektroporatie (in video)
- Na de euthanasie een zwangere vrouw, ontleden embryo's in ijs koud volledige HBSS. KeEp elk embryo in hun individuele placenta zakken.
- Ontleden embryo uit en sneed de kop na de eerste wervel. Houd in ijskoud volledige HBSS.
- Voor injectie, plaats het hoofd op een stuk Parafilm op een petrischaal. Met maat Hamilton spuit (zie Tabel I) ongeveer 6 tot 8 pi DNA injecteren: snelle groene kleurstof mix door de derde ventrikel om vullen laterale ventrikels in de corticale vesicles. Als alternatief kan injectie rechtstreeks worden in elke laterale ventrikel.
- Voor de ex vivo elektroporatie, gebruik maken van BTX-pincet platina elektroden. Plaats de positieve elektrode naar de zijkant van de cortex dat u wilt ie top van het hoofd electroporate voor de dorsale cortex.
- Na elektroporatie incuberen de kop op ijs gedurende ten minste 5 minuten voor ontleding.
- Ontleden hersenen in ijskoud HBSSby het maken van een kleine incisie aan de zijkant van het hoofd en peeling van de huid van de zijkanten van het hoofd. Vervolgens metfijne pincet voorzichtig afpellen van de pia van de hersenen. Verwijder de intacte hersenen uit de schedel, zorg ervoor dat u de cortex beschadigd.
5. Inbedding en Opdeling van geëlektroporeerd cortex (in video)
- Overdracht 3% laag smeltpunt agarose in een grote mal op ijs. De onderkant van de mal sneller gaan die hersenen verhinderen zinken naar de bodem van de vorm stollen. Voorzichtig, over te dragen hersenen met een fijne pincet een voor een na het verwijderen van overtollige buffer met een Kimwipe of filtreerpapier. Gebruik een 10 pi pipet tip om werveling van de hersenen in de mal om een maximale interface tussen de agarose en hersenweefsel te garanderen.
- Plaats de hersenen alle hersenen waarborgen in dezelfde richting en ongeveer hetzelfde niveau in de agarose. Laat de agarose stolt gedurende ongeveer 5 minuten. Gebruik lijm (gek lijm) aan de agarose blokken, zodat de olfactorische bollen staan op te bevestigen. Wanneer de blokken verbonden zijn, direct toevoegen ice koude HBSS en trim de agarose om te zorgen dat afzonderlijke segmenten te worden verkregen voor elke hersenen.
- Om de blokken snijden, stelt u de vibratome de snelheid op een lage snelheid (ongeveer de helft van het maximum) en zet het mes trillingsfrequentie op de hoogste stand. Genereer voor 250 micrometer dikke coronale plakken. Haal plakken met behulp van een gebogen fijne spatel en overbrengen naar weefsel putten met een fijne borstel of een tang.
- In weefselkweek kap, over te dragen sneetjes in met coating. Voeg 500 ul van slice voedingsbodems voor elke insert om de overdracht eenvoudig. Tot 5 plakjes kunnen worden geplaatst per insert. Overtollig materiaal uit de top van de segmenten en incuberen bij 37 ° C in bevochtigde incubator.
6. Cultuur en Analyse van organotypische Slices (in video)
- Om gezonde schijven houden, moet vers medium worden toegevoegd in ten minste om de andere dag onder het membraan door het vervangen helft van de media telkens.
- Om plakken analyse na desired dagen in cultuur, vast plakken in het membraan. Wassen met 1x fosfaat fysiologische zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C driemaal 10 minuten per keer. Vervolgens nacht vast met 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C of gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Slices kunnen worden geanalyseerd met verschillende cellulaire merkers of gekleurd met Hoechst alleen om geëlektroporeerde en niet-geëlektroporeerde cellen te visualiseren. Permeabilize en blokkeren plakjes 2 uur bij kamertemperatuur met 10% serum geit, 0,1% Triton in PBS met 1 x zachtjes schudden.
- Vlek met Hoechst gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, was 3 maal met PBS 1x 10 min telkens zachtjes schudden.
- Voor de montage plakjes snijden het membraan met een scalpel, en met een fijne tang om het membraan met plakjes op een mat glas te dragen dia's in een waterreservoir. Tot 5 plakjes kunnen worden geplaatst per glasplaatje. Verwijder overtollig water, en voeg een druppel Flourmount oplossing voor elke hersenen slice. Plaats voorzichtig een dekglaasje op de top van de hersenen plakjes en verwijder eeny luchtbellen. Analyseren segmenten met een confocale microscoop.
7. Alternatieve paraffine inbedding van organotypische Slices (niet in video)
- Organotypische plakjes kunnen worden ingesloten voor paraffine een fijnere morfologische analyse daartoe het membraan dat het organotypische plakjes kunnen worden gefixeerd in 4% PFA zoals hierboven beschreven.
- De vaste schijven zijn ingebed in 1% agarose (voorverwarmd tot 37 ° C) en verhard in ijs gedurende 30 minuten. De agarose blokken kunnen vervolgens na gefixeerd in 4% PFA bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- De agarose blok met de organotypische segment wordt dan ingebed in paraffine en verwerkt voor immunofluorescentie zoals reeds beschreven 10.
8. Representatieve resultaten
Een schematische weergave van de elektroporatie van muizen cortex en cultuur organotypische segmenten is in figuur 1. Deze methode is een nuttige strategie voor rapid beoordeling van de functie van genen die betrokken zijn bij neuronale ontwikkeling 11. Afhankelijk van de hoeveelheid DNA geëlektroporeerde en embryonale stadium elektroporatie de transfectie-efficiëntie variëren. Slices start uiten GFP ten minste 8 uur na de elektroporatie en cellen zal het normale verloop van neurogene evenementen (proliferatie, migratie, en het begin van neuronale differentiatie) in de cultuur te ondergaan. Figuur 2 toont een geëlektroporeerde hersenen slice dat is het uiten van een controle pSilencer-GFP vector en men kan waarnemen neuronale voorlopercellen, de migratie van neuronen en gedifferentieerde neuronen in de slice. Organotypische segmenten behouden hun morfologie zolang zij in een goede media lucht interface op de membranen en kan worden tot ten minste 5 dagen kweek.
Figuur 1. Illustratie van ex vivo elektroporatie en organotypische slicecultuur assay. E14.5 embryo ontleed uit, en individueel geïnjecteerd met DNA gemengd met snelle groene kleurstof om de injectie visualiseren. DNA kan worden geïnjecteerd in zowel de laterale ventrikels zoals weergegeven in de tekening of derde ventrikel om de laterale ventrikels vullen. Na injectie worden de hersenen geëlektroporeerd met een blokgolf electroporator, het plaatsen van de positieve elektrode aan de gewenste zijde van de hersenen. Hersenen zijn ingebed in 3% laagsmeltend agarosegel en coupes met een vibratome. 250 pm hersenplakjes worden gebracht 0,4 pm inserts en gekweekt tot een week. GFP kan worden waargenomen na 8 uur na transfectie.
Figuur 2. Analyse van geëlektroporeerde hersenplakjes. Geëlektroporeerd hersenen plakjes werden gekleurd voor Hoescht. Dorsale cortex toont geëlektroporeerd neuronale voorlopercellen in de ventriculaire zone (vz). Neuronen in de Cortical plaat (cp) worden begrensd door de marginale zone (MZ). Witte pijlen geven migreren neuronen. In dit geval werden hersenen geïnjecteerd E15.5 en geëlektroporeerd met pSilencer GFP controle vector. De secties vertegenwoordigen corticale explantaten 4 dagen na elektroporatie. Schaal bar 100 urn.
Problemen oplossen:
- Laag transfectie efficiëntie: Stel de concentratie van DNA werd gebruikt om tenminste 1 ug / pl. Gebruik altijd zeer schoon DNA van een maxi prep gebruik zo nodig een endo-vrij Quiagen kit om het DNA te zuiveren.
- Cellen getransfecteerd in een ander gedeelte van de hersenen dan de gewenste: zorgen dat de elektroden kunnen worden geplaatst met de positieve elektrode positie naar de kant van de hersenen te geëlektroporeerd.
- Organotypische plakjes verliezen morfologie: Change media elke dag en zorgen voor de schijfjes zijn niet zweven in de media
- Slices komen uit de agarose als ze worden gesneden in de vibratome: Zorg ervoor dat een goede interface is gemaakt wanneer het inbedden van de hersenen in de lage smeltpunt agarose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methoden met betrekking tot de ex vivo elektroporatie van plasmiden die coderen voor dubbelstrengs RNA haarspelden 8 en cultuur van organotypische plakjes 4 geven een aantal duidelijke voordelen. Ten eerste, deze methoden zorgen voor een snelle beoordeling van de RNAi-afgeleide fenotypes. Het opnemen van een expressiecassette codering GFP in dezelfde vector pSilencer de U6 promotor die de dubbelstrengs RNA haarspeld aandrijft bevat zorgt voor een snelle identificatie en karakterisering van cellen geëlektroporeerd met RNAi vector. Naast tijd rendement Deze werkwijzen zijn zeer rendabele opzichte van de opwekking van verschillende knock-out lijnen. Ten tweede, in vergelijking met de overleving van elektroporatie technologie 12, die meer training en ontwikkeling van vaardigheden om te overleven van het dier en het succes van de elektroporatie zorgen nodig heeft, hier beschreven methoden kunnen worden uitgevoerd met een kortere trainingstijd en vaardigheid. De overlevingsduur in vivo surgeries worden ook bezoedeld door een basislijn percentage mislukkingen die geassocieerd kan worden met dierlijke (moeder en pup) morbiditeit. Deze dieren zullen regelmatig moeten worden beoordeeld door redelijk geschoold personeel en / of dierenartsen van het dier faciliteit. Ten derde, omdat ze worden gekweekt voor maximaal 5 dagen of meer in vitro, ze stellen ons in staat een breed scala van vragen met betrekking tot neuronale proliferatie, lot van de cel bepalen, neuronale migratie en de vroege stadia van de neuronale rijping (neurietuitgroei) aan te pakken. Ten vierde, omdat we werken in de cultuur, zijn wij ook in staat om exogene factoren toe te voegen aan de rol van groeifactoren en farmaceutische middelen te testen in de beschreven neurologische mechanismen. Ten vijfde, de elektroporatie aanpak van ex-vivo is te verkiezen boven een gen pistool aanpak omdat het richten van specifieke gebieden van de hersenen, doordat het oriënteren van de elektroden. Tot slot, in vergelijking met virale transductie van organotypische plakken de elektroporatie aanpak zorgt voor een hogere TRAnsfection efficiëntie van primaire cellen.
Deze methodes hebben wel een paar beperkingen. Tenzij de slice techniek wordt aangepast om langere periodes cultuur houden, kunnen deze methoden niet ideaal zijn om synaptogenese of ontwikkelingsproblemen gebeurtenissen die later plaatsvinden beoordelen. Een verdere beperking mogelijk dat de reproduceerbaarheid van de resultaten is sterk afhankelijk elektrodeplaatsing. Sommige praktijk moet elektroporatie van dezelfde hersengebied die reproduceerbaarheid verhoogt waarborgen. Ten slotte is het onderhoud van de lucht / vloeistof interface is ook van cruciaal belang om ervoor te zorgen gezonde plakjes. Zoals hierboven beschreven, verwachten we dat deze vaardigheden kan gemakkelijk worden overgenomen door de Jupiter lezers, en dat de sterke punten van deze methoden sterk opwegen tegen de beperkingen met de juiste toepassing. Samengevat, wordt gewervelde neurologische gecontroleerd door een groot aantal genen. Neuronale morfogenese in het bijzonder is een zeer interessant en belangrijk onderwerp. Deze aanpak maakt hetvoor een zeer efficiënte methode voor het screenen van gen-functie tijdens neurologische ontwikkeling en kan een zeer breed scala aan experimentele doeleinden dienen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr Shirin Bonni voor het verschaffen van pSil-GFP-construct, Dr Alper Uzun ter illustratie van figuur 1 en de Leduc BioImaging inrichting voor confocale microscopie. EMM wordt ondersteund door de Career Award voor Medische Wetenschappen van de Burroughs Wellcome Fund, een NARSAD Young Investigators Award, en NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01. SBL wordt ondersteund door NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01, en heeft steun gekregen van PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX Technologies | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX Technologies | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX Technologies | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | Leica Microsystems | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | Falcon BD | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | Falcon BD | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Low Melting Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma-Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma-Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B. Jr, Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
