Summary
我们描述涉及的方法进行快速评估的功能基因在大脑皮层的发展，
Abstract
大脑皮质的指示较高的认知功能。这6个层状结构会产生一个内部第一，外部最后的方式，其中第一个出生的神经元保持密切的心室，而去年出生的神经元迁移过去的第一个出生的神经细胞向大脑表面1。除了 神经细胞迁移2，皮质功能正常的一个关键过程是调节神经元的形态3。虽然神经元形态，可在原代培养体外研究，有多少要了解到，从这些过程是如何在组织环境监管。
我们描述的技术来分析神经细胞迁移和/或在大脑皮层的器官切片4,6形态。用于修改一个pSilencer载体，其中包含同时U6启动子驱动的双链发夹RNA和一个单独的编码绿色荧光蛋白表达盒驱动b雅CMV启动子7-9。我们的方法允许候选基因的具体击倒后突起生长的缺陷快速评估，并已成功用于在屏幕上一个突起生长8监管。因为只有一部分细胞会表达的RNAi构造，器官切片允许镶嵌一个潜在的表型分析。此外，因为这种分析是在附近近似体内环境，它提供了一个低成本为皮质功能未知的基因，并迅速替代代转基因或基因敲除动物。最后，在体内电穿孔技术相比， 体外电击实验的成功是不依赖于熟练的手术技巧的发展，可以用更短的训练时间和技能进行。
Protocol
1。准备培养液和媒体（不是视频）
- 准备完整汉克平衡盐溶液（HBSS中）含有1X HBSS中，2.5毫米HEPES液（pH7.4），30毫米D-葡萄糖，1毫米氯化钙 ，硫酸镁4 1毫米和4毫米碳酸氢钠3 1升。加入双蒸水（DDH 2 O）的。过滤消毒用0.2微米的过滤器，并储存于4°C。
- 准备片用35毫升基础培养基鹰媒体的培养基，完整的HBSS 12.9毫升，20毫米D-葡萄糖（1.35毫升的1 M的解决方案），1毫米Glutamax 200毫米的解决方案（0.25毫升），0.5 ml青霉素链霉素100X股票的。 0.2微米的过滤器过滤消毒，然后加入热灭活马血清终浓度为5％。
- 准备1毫克/毫升原液用无菌蒸馏水去离子水层粘连蛋白，层粘连蛋白工作的解决方案。准备在0.5毫升离心管加入100μL分装和冻结在-80°C。
- 所以准备聚-L-赖氨酸的工作lution通过加入聚-L-赖氨酸5毫克，1毫克/毫升原液5毫升无菌H 2 O。准备1毫升分装和冻结，在-20°C
- 准备到终体积12毫升无菌水稀释1毫升聚-L-赖氨酸和100μL粘连涂层解决方案。每次作出新的这一解决方案。
2。准备器官切片插入（没有视频）
- 准备一个文化的插入，每孔用无菌镊子两个六孔板。加入2毫升无菌DDH 2 O的下方的文化插入。
- 加入1毫升的照顾，不穿刺膜的膜之上的涂层解决方案。在饱和湿度培养箱隔夜在37°C和5％的CO 2。
- 除去包衣介质，并用无菌H 2 O三次膜。让我们在使用前插入干。加入1.8毫升片培养基，在37°C间孵化器的地方。用封口膜包住未使用的板块在4°C存储长达4周。
3。电穿孔的准备（没有视频）
- 准备电击的RNAi构造。双链RNA发夹插入克隆到pSilencer载体。质粒含有：1）1 U6启动子驱动的双链RNA代和2）的GFP表达盒由CMV启动子8,9驱动。这种质粒以前一直由小西和他的同事和其他7,8描述。质粒纯化使用Qiagen公司的最大准备套件，并在1毫克/毫升的浓度使用。
- 以可视化的DNA，而注射，准备了0.5％的快速绿色染料溶液和使用它的DNA被注入（通常为20μL的DNA 1μL快速绿色）在1:20。超过离开的DNA快速绿色染料混合物可以储存在-20°C到一个星期。
- 清洁的清扫面积，dissecti吴用70％乙醇的工具和vibratome船只。冷藏完整的HBSS，以便它是冰冷的。的寒意vibratome船只围绕它包装内快速冷却的vibratome一些水冰。使用完整的HBSS，准备3％低熔点琼脂糖。微波1分钟。避免了沸点。保持在42℃水浴，直至使用。
- 电参数设置如下。 1 E15胚胎使用35伏特，5个脉冲，长100毫秒，900毫秒脉冲之间的间隔。对于年龄较大的动物，以确保电，使用更高的电压高达50 V或增加脉冲数高达8个脉冲。为了防止损坏，在年轻的动物组织，使用更少的脉冲或2脉冲和低电压高达25 V。这些参数可能是多种多样的，凭经验确定取决于动物的年龄。
4。解剖和电（视频）
- 安乐死女性怀孕后，解剖胚胎放进冰水里完成的HBSS。柯EP在各自的胎盘囊胚胎。
- 解剖胚胎，并切断后的第一颈椎头。保持在冰冷的完整的HBSS。
- 注射，头放在一块培养皿上的封口膜。使用自定义Hamilton注射器（ 见表一 ）注入约6至8μL的DNA：通过第三脑室快速绿色染料混合，以填补皮质囊泡两侧脑室。另外，注射可以直接进入每一个侧脑室。
- 为体外电击，使用BTX-镊子铂电极。背皮质即头顶部electroporate的皮质，你想向一侧放置正极。
- 电击后，静置至少5分钟前解剖上冰元首。
- 解剖大脑在使冰冷HBSSby的头部一侧的一个小切口，剥离头的两侧皮肤的折扣。下一步，细镊子轻轻剥离从脑软。从头骨完整的大脑取出，注意不要损坏皮质。
5。嵌入和电穿孔皮质切片（视频）
- 3％低熔点琼脂糖转移到冰上放置了一个大型模具。模具的底部将开始固化速度更快，这将防止下沉模具底部的大脑。轻轻地，转移与细镊子取出后多余的缓冲，与Kimwipe或滤纸的大脑。使用10微升吸管尖漩涡的大脑内的模具，以确保琼脂糖和脑组织之间的最大接口。
- 东方的大脑，以确保所有的大脑都在同一方向，并在同一水平在琼脂糖。让琼脂糖巩固约5分钟。使用粘接胶（疯狂胶），使嗅球站在重视琼脂糖块。一旦块被重视，立即加我每个大脑获得CE冷的HBSS和琼脂糖修剪，以确保个人片。
- 切块，低速（约一半的最大值）设置的vibratome的速度和叶片的振动频率设置在最高设置。产生250微米厚的冠状切片。检索切片，用弯曲的细铲，并用细刷或镊子转移他们组织井。
- 在组织文化的引擎盖，转移到片涂层刀片。加入500μL片培养基每个插入容易转移。每个刀片可放置多达5片。删除多余的介质，从切片的顶部，并在37°C在加湿的孵化器孵化。
6。文化和器官切片分析（视频）
- 为了保持健康的切片，新鲜媒体应增加至少隔日膜取代一半的媒体每次下方。
- 为了分析切片后的d文化esired天，固定在膜切片。 1X的磷酸盐缓冲液（PBS）的37°C间三次，每次10分钟洗净。接下来，4％多聚甲醛（PFA）过夜固定在4°C或在室温下为1小时。
- 片可以分析不同的细胞标记或单独用Hoechst染色，电穿孔和电穿孔非细胞可视化。通透和阻止片2小时，在室温下用10％山羊血清，0.1％，在1X PBS轻轻摇动TRITON。
- 用Hoechst染色在室温下为1小时，用3次，每次10分钟1X PBS轻轻摇动。
- 要挂载切片用手术刀膜，并用细镊子转移一个磨砂玻璃片膜在水室的幻灯片。可以置于载玻片每到5片。删除多余的水，并添加一个解决方案，每个大脑切片Flourmount下降。轻轻地放在大脑切片上盖玻片，并删除Ÿ气泡。利用共聚焦显微镜分析片。
7。替代器官切片石蜡包埋（没有视频）
- 也可以被嵌入器官切片石蜡更精细的形态分析，为此包含的器官切片的膜，可固定在煤灰作为以上所述的4％。
- 固定片嵌入在1％琼脂糖（预先加热至37°C），并在冰凝固为30分钟。琼脂糖块，然后可以在4℃后固定为30分钟，在4％的煤灰。
- 琼脂糖块包含的器官切片，然后将石蜡包埋免疫处理，如先前所述10。
8。代表结果
如图1所示的小鼠皮层和文化的器官切片电图解。这种方法是一个RAPI有用的战略ð评估功能在神经元发育有关的基因11。根据量DNA的电穿孔和电在萌芽阶段，转染效率会有所不同。片会开始表达绿色荧光蛋白至少8个小时后，电和细胞将进行正常的神经活动，在文化（增殖，迁移和早期神经细胞分化）序列图2显示了一个电脉冲的大脑切片，表达了控制pSilencer-GFP的向量和一个可以观察到神经元祖细胞，神经元迁移和分化的神经元在片。器官切片将保持其形态，只要他们保持在一个良好的媒体空气膜接口，可以使用至少5天的文化。
图1。插图体外电击和器官切片培养法。E14.5胚胎解剖，快速的绿色染料混合的DNA与单独注射，以可视化的注射部位。 DNA可在两个侧脑室注射插图描绘，以填补侧脑室或第三脑室。注射后大脑电穿孔方波electroporator，正电极放在大脑所需的一面。大脑在3％低溶点琼脂糖和切片使用vibratome嵌入。 250微米的大脑切片放在0.4微米插入，并培养了一个星期。转染后8小时后可观察到绿色荧光蛋白。
图2。电脉冲的大脑切片分析。电穿孔的大脑切片进行染色赫司特。背的皮质神经祖细胞电穿孔在脑室区（VZ）。 CORTI中的神经元CAL板（CP）是由边缘区（MZ）分隔。白色箭头显示移植的神经元。在这种情况下，被注入大脑在E15.5与pSilencer GFP控制向量与电穿孔。部分代表电后4天的皮质外植体。比例尺100微米。
故障排除：
- 转染效率低：调整用于至少为1μg/μL的DNA浓度。总是从马克西准备使用非常干净的DNA，如果必要使用内免费Quiagen的试剂盒纯化的DNA。
- 转染细胞在不同的大脑区域，一个比一个期望：确保向一侧被电脑的正极位置正确，电极定位。
- 片失去器官形态变化的媒体每天，确保片漂浮在媒体
- 琼脂糖片脱落，因为他们正在削减在vibratome：确保良好的界面嵌入在低熔点琼脂糖时的大脑。
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Discussion
这些方法包括体外电击质粒编码双链RNA发夹和器官切片4提供了几个明显的优势文化。首先，这些方法可以快速评估为RNAi派生的表型的。 pSilencer载体包含U6启动子驱动的双链RNA发夹编码绿色荧光蛋白表达盒中列入允许细胞电穿孔与RNAi载体的快速识别和表征。除了时间效率，这些方法具有高度成本效益的几个淘汰赛行产生相比。第二，与生存电技术12，需要较长的培训和技能发展，以确保动物的生存和成功的电相比，这里描述的方法，可以用更短的训练时间和技能。 在体内存活小号urgeries也陷入基线动物（母亲和小狗）的发病率可能与相关的故障率。这些动物经常会需要相当熟练的员工和/或从动物设施的兽医评估。第三，因为他们是5天或更长时间在体外培养，他们让我们来解决一系列的神经细胞增殖，细胞命运的决心，神经细胞迁移和神经细胞成熟的早期阶段（突起生长）有关的问题。第四，是因为我们在文化工作，我们也可以添加外源性因素的测试中所述的神经机制作用的生长因子和药剂。第五，电穿孔的方法前体内基因枪的方法是最好的，因为它允许精确定向电极针对大脑的特定区域。最后，病毒转导的器官切片相比电击方法允许更高TRA原电池nsfection效率。
这些方法也有一些限制。除非切片技术进行了修改，维持较长的文化时期，这些方法可能并不理想，以评估突触或发育事件发生后。可能是重复性的结果是高度依赖电极上放置一个额外的限制。一些做法需要电，以确保相同的大脑区域，从而提高结果的可重复性。最后，气/液界面的维护，也是至关重要的，以确保健康切片。如上所述，我们预期的朱庇特的读者可以很容易地获得这些技能，这些方法的优势大大超过给予相应的应用程序的限制。总之，脊椎动物的神经系统发育大量的基因控制。在特定的神经元的形态是一个非常有趣的和重要的课题。这种方法允许为筛选在神经发育过程中基因功能的一种高效的方法，并可能成为一个实验目的的范围非常广泛。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢提供的pSil-GFP的结构图1的插图，博士阿尔珀乌尊，共聚焦显微镜勒杜克生物成像设备，博士希林Bonni。电解金属锰支持从巴勒斯惠康基金，NARSAD奖的年轻研究者，美国国立卫生研究院NCRR COBRE P20的RR018728-01职业医学科学奖。借券支持由美国国立卫生研究院NCRR COBRE P20的RR018728-01，并已收到小灵通NRSA 5T32MH019118-20的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX Technologies | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX Technologies | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX Technologies | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | Leica Microsystems | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | Falcon BD | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | Falcon BD | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Low Melting Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma-Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma-Aldrich | H4034 |
References
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