Metoder for å studere nevrale morphogenesis:<em> Ex vivo</em> RNAi electroporation i Embryonic murin Cerebral Cortex

Summary

Å foreta en rask vurdering av funksjon av gener i utviklingen av cerebral cortex, beskriver vi metoder som involverer<em> Ex vivo</em> Electroporation av plasmider co-uttrykke hemmende RNA (RNAi) og GFP i murine embryonale cortex. Denne protokollen er mottagelig for studiet av ulike aspekter av neurodevelopment som neurogenesis, neuronal migrasjon og neuronal morphogenesis inkludert dendrite og axon utvekst.

Abstract

Hjernebarken styrer høyere kognitive funksjoner. Dette seks lagdelt struktur er generert i en innside-første, utenfor-siste måte, der de første født nervecellene forblir nærmere ventrikkel, mens de siste født nervecellene vandrer forbi de første født nevronene mot overflaten av hjernen ^en. I tillegg til neuronal migrasjon ^2, er en viktig prosess for normal kortikal funksjon regulering av nevronale morphogenesis ^tre. Mens neuronal morphogenesis kan studeres in vitro i primære kulturer, det er mye å lære fra hvordan disse prosessene er regulert i vev miljøer.

Vi beskriver teknikker for å analysere neuronal migrasjon og / eller morphogenesis i organotypic skiver av hjernebarken ^4,6. En pSilencer endret vektor benyttes som inneholder både en U6 promoter som driver de doble strandede hårnål RNA og en separat uttrykk kassett som koder GFP protein drevet bya CMV promoter ^7-9. Vår tilnærming åpner for rask vurdering av mangler i neurite utvekst på spesifikk knockdown av kandidat gener og har blitt brukt i en skjerm for regulering av neurite utvekst ^8. Fordi bare en undergruppe av celler vil uttrykke RNAi konstruerer, de organotypic skiver gi rom for en mosaikk analyse av potensielle fenotyper. Videre, fordi denne analysen er gjort i en nær tilnærming til in vivo miljøet, gir det en lav pris og rask alternativ til generering av transgene eller knockout dyr for gener med ukjent kortikal funksjon. Til slutt, i sammenligning med in vivo electroporation teknologi, er suksessen til ex vivo electroporation eksperimenter ikke avhengig av dyktige kirurgi kompetanseutvikling og kan utføres med en kortere opplæringstid og dyktighet.

Protocol

1. Forbereder Kultur Solutions og media (ikke i video) Forbered 1 liter Complete Hank balanserte saltløsning (HBSS) inneholder 1x HBSS, 2,5 mm Hepes (pH7.4), 30 mm D-glukose, 1 mm 2 CaCl, 1 mm MgSO 4 og 4 mm NaHCO 3. Legg dobbel destillert vann (DDH 2 O). Filtrer sterilisere med en 0,2-mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C. Forbered skive kultur medium å bruke 35 ml av Basal Medium Eagle media, 12,9 mL av komplette HBSS, 20 mm D-glukose (1,35 mL 1 M…

Discussion

Disse metodene involverer ex vivo electroporation av plasmider som koder dobbel strandet RNA hårnåler ⁸ og kultur organotypic skiver ⁴ gir flere klare fordeler. Først disse metodene gir mulighet for en rask vurdering av RNAi-deriverte fenotyper. Inkludering av et uttrykk kassett koding GFP i samme pSilencer vektor som inneholder U6 arrangøren som driver den doble strandet RNA hårnål gir en rask identifisering og karakterisering av celler electroporated med RNAi vektor. I tillegg til …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Hamilton syringe	HAMILTON	80008	31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume
Platinum tweezertrodes	BTX	45-0489	5mm size
ECM830 electroporator	BTX	45-0002
BTX Footswitch	BTX	45-0208	For use with ECM830 electroporator
Vibrating blade microtome	LEICA	VT1000 S
6- well dish to use with inserts	FALCON	353502	Contains notches to fit inserts
Tissue culture inserts	FALCON	353090	0.4 micrometer
Fast Green	SIGMA	F7252
Low Melting Agarose	FISHER	BP165-25	DNA grade
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P5899
Basal Medium Eagle	Sigma Aldrich	B-1522
HBSS 10x without Ca and Mg	GIBCO	14180-046
HEPES-free acid	Sigma- Aldrich	H4034