Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em> Ex vivo</em> RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex
Summary
Om een snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen waarbij<em> Ex vivo</em> Elektroporatie van plasmiden co-expressie remmende RNA (RNAi) en GFP in muizen embryonale cortex. Dit protocol is vatbaar voor de studie van verschillende aspecten van de neurologische ontwikkeling, zoals neurogenese, neuronale migratie en neuronale morfogenese waaronder dendriet en axon uitgroei.
Abstract
De cerebrale cortex leidt hogere cognitieve functies. Deze zes gelaagde structuur wordt gegenereerd in een in-first buiten-last wijze, waarbij de eerste geboren neuronen dichter blijven de hartkamer en de laatste geboren neuronen migreren voorbij de eerste geboren neuronen naar het oppervlak van de hersenen 1. Naast de neuronale migratie 2, een belangrijke proces voor normale corticale functie is de regulering van de neuronale morfogenese 3. Terwijl neuronale morfogenese bestudeerd kan worden in vitro in primaire culturen, is er veel te leren van de manier waarop deze processen worden geregeld in weefsel omgevingen.
We beschrijven technieken om neuronale migratie en / of morfogenese in organotypische plakken van de cerebrale cortex 4,6 analyseren. Een pSilencer gewijzigd vector wordt gebruikt die zowel een U6 promotor die de dubbelstrengs RNA haarspeld rijdt en een aparte expressiecassette dat GFP-eiwit codeert gedreven bya CMV promoter 7-9. Onze aanpak maakt het mogelijk voor de snelle beoordeling van de gebreken in neurietuitgroei op specifieke knockdown van kandidaat-genen en is met succes gebruikt in een scherm voor regulatoren van neurietuitgroei 8. Omdat er slechts een subset van cellen drukken de RNAi constructen, de organotypische plakjes zorgen voor een mozaïek analyse van de mogelijke fenotypes. Bovendien, omdat deze analyse wordt uitgevoerd in een bij aanpassing van de in vivo milieu, het een goedkope en snelle alternatief voor het genereren van transgene of knockout dieren genen bekend corticale functie. Tot slot, in vergelijking met de in vivo elektroporatie technologie, het succes van ex vivo elektroporatie experimenten is niet afhankelijk van bekwaam een operatie ontwikkeling van vaardigheden en kunnen worden uitgevoerd met een kortere trainingstijd en vaardigheid.
Protocol
Discussion
Deze methoden met betrekking tot de ex vivo elektroporatie van plasmiden die coderen voor dubbelstrengs RNA haarspelden 8 en cultuur van organotypische plakjes 4 geven een aantal duidelijke voordelen. Ten eerste, deze methoden zorgen voor een snelle beoordeling van de RNAi-afgeleide fenotypes. Het opnemen van een expressiecassette codering GFP in dezelfde vector pSilencer de U6 promotor die de dubbelstrengs RNA haarspeld aandrijft bevat zorgt voor een snelle identificatie en karakteriserin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr Shirin Bonni voor het verschaffen van pSil-GFP-construct, Dr Alper Uzun ter illustratie van figuur 1 en de Leduc BioImaging inrichting voor confocale microscopie. EMM wordt ondersteund door de Career Award voor Medische Wetenschappen van de Burroughs Wellcome Fund, een NARSAD Young Investigators Award, en NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01. SBL wordt ondersteund door NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01, en heeft steun gekregen van PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B., Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
