לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות הקשורות<em> לשעבר vivo</em> Electroporation של פלסמידים שיתוף להביע RNA מעכבות (RNAi) ו-GFP בקליפת המוח העוברי murine. פרוטוקול זה הוא מקובל בחקר היבטים שונים של neurodevelopment כגון neurogenesis, העברה עצבית ו המורפוגנזה העצבית כולל דנדריט ו תוצאה האקסון.
קליפת המוח מכוון את התפקודים הקוגניטיביים. מבנה זה 6 שכבות נוצרת באופן בפנים ואחת בחוץ, האחרון, שבו הנוירונים הראשונים שנולדו להישאר קרוב יותר החדר ואילו נוירונים שנולדו האחרונות להעביר בעבר הנוירונים שנולדו הראשונים לקראת פני השטח של המוח 1. בנוסף העברה עצבית 2, תהליך מפתח לתפקוד קליפת המוח הנורמלי הוא הסדרת המורפוגנזה עצבית 3. בעוד המורפוגנזה עצבי ניתן ללמוד במבחנה בתרבויות העיקריות, יש הרבה מה ללמוד מהדרך שבה תהליכים אלה מוסדרים בסביבות רקמות.
אנו מתארים טכניקות לניתוח ההגירה העצבית ו / או המורפוגנזה של פרוסות organotypic של קליפת המוח 4,6. וקטור pSilencer שונה משמש המכיל גם מקדם U6 שמניע את RNA כפולים חדים תקועים ואת קלטת ביטוי נפרד המקודד חלבון ה-GFP מונע ביה CMV האמרגן 7-9. הגישה שלנו מאפשר הערכה מהירה של ליקויים תוצאה neurite על מציאה מסוים של גנים מועמדים ונעשה בו שימוש בהצלחה המסך של הרגולטורים של תוצאה neurite 8. כי רק קבוצת משנה של תאים יביע המבנים RNAi, את פרוסות organotypic לאפשר ניתוח פסיפס של פנוטיפים פוטנציאליים. יתר על כן, כי ניתוח זה נעשה אומדן של קרוב בסביבה vivo, הוא מספק עלות נמוכה אלטרנטיבה מהירה לדור של בעלי חיים מהונדס או נוק אאוט לגנים של תפקוד קליפת המוח ידוע. לבסוף, בהשוואה בטכנולוגיה electroporation vivo, את ההצלחה של הניסויים electroporation לשעבר ב vivo אינה תלויה בפיתוח ניתוח מיומן מיומנות ניתן לבצע עם זמן אימון קצר ומיומנות.
שיטות אלה מעורבים electroporation vivo לשעבר של פלסמידים קידוד כפולה גדילי RNA סיכות ראש 8 והתרבות של פרוסות organotypic 4 מספקים מספר יתרונות בולטים. ראשית, שיטות אלו מאפשרים הערכה מהירה של RNAi הנגזרות פנוטיפים. הכללתו של ה-GFP קלטת קידוד ביטוי וקטור pSilencer אותו המכיל מק?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לד"ר שירין Bonni למתן pSil-GFP מבנה, ד"ר אלפר Uzun להמחשה של איור 1, ואת מתקן bioimaging לדוק עבור מיקרוסקופיה confocal. EMM נתמך על ידי פרס קריירה למדע רפואי Wellcome בורוז קרן, פרס חוקרים NARSAD יאנג, ו-NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01. SBL נתמך על ידי NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01, וקיבל תמיכה PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
Fast Green | SIGMA | F7252 | |
Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |