ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية
Summary
وقد تم تكييف هذه التقنية لتحليل مورفولوجيا CLEM التركيبية للأغشية، العضيات، والهياكل المتضررة من الجزيئات التحت خلوية microinjected. هذا الأسلوب يجمع بين تقنيات قوية من المجهرية / حقن مكروي، المجهري متحد البؤر الفلورسنت، والمجهر الإلكتروني للسماح للقرار نانومتر ملليمتر متعددة. هذه التقنية هي قابلة للطائفة واسعة من التطبيقات.
Abstract
الخلية حقيقية النواة تعتمد على التعقيد، درجة عالية من التنظيم، ومقصورات غشاء متميزة وظيفيا المنضم الذي الحفاظ على الاستقطاب البيوكيميائية اللازمة لوظيفة الخلوية المناسبة. فهم كيفية الانزيمات والبروتينات، ومكونات هيكل الخلية والحفاظ على هذا الحكم الفصل البيوكيميائية لذلك من أهمية قصوى. استخدام جزيئات الموسومة fluorescently في توطين و / أو حجرات التحت خلوية التشويش قد حقق ثروة من المعرفة وتقدم فهمنا لتنظيم الخلوية. تقنيات التصوير مثل المجهر الفلورسنت ومبائر جعل التحقق من موقف جزيء صغير الموسومة fluorescently مباشرة نسبيا، ومع ذلك يقتصر القرار هياكل صغيرة جدا 1.
من ناحية أخرى، كشف المجهر الإلكتروني تفاصيل التشكل التحت خلوية بدقة عالية جدا، ولكن طبيعته ثابتة يجعل من الصعب قياس ديناميكية للغاية بروcesses بدقة 2،3. وبالتالي، فإن الجمع بين المجهر الضوئي المجهر الإلكتروني مع لنفس العينة، ضوء مترابط ويسمى المجهر الإلكتروني (CLEM) 4،5، يتيح مزايا التصوير فائق السرعة المزدوجة من الفلورسنت مع قرار عالية من المجهر الإلكتروني 6. وقد تم تنفيذ هذه التقنية قوية لدراسة العديد من جوانب بيولوجيا الخلية 5،7. منذ نشأتها، وقد زاد هذا الإجراء قدرتنا على التمييز بين الأشكال التضاريسية وأبنية التحت خلوية بدقة عالية.
هنا، نقدم طريقة مبسطة لأداء حقن مكروي السريع تليها CLEM (الشكل 1). ويمكن استخدام هذا الإجراء حقن مكروي CLEM لإدخال كميات محددة من جزيئات صغيرة و / أو البروتينات مباشرة في السيتوبلازم الخلية حقيقية النواة ودراسة آثار من المليمتر لموضوع القرار نانومتر (الشكل 2). ويستند هذا الأسلوب على microinjectingالخلايا المزروعة في coverslips الزجاج المحفور بالليزر الشبكية الملصقة على الجزء السفلي من الخلية الحية والأطباق التصوير المجهري متحد البؤر مع كل من الفلورسنت والإلكترونات. ومما يسهل توطين الخلية (ق) من الفائدة من جانب نمط الشبكة، والتي يمكن نقلها بسهولة، جنبا إلى جنب مع خلايا الفائدة، إلى الراتنج EPON تستخدم لتجميد العينات وتقطيع قبل تحليل المجهر الإلكتروني (الشكل 3). تراكب الصور من الفلورسنت وEM يسمح للمستخدم لتحديد توطين التحت خلوية، فضلا عن أي تغيرات شكلية و / أو التركيبية الناجمة عن جزيء microinjected من الفائدة (الشكل 4). هذه التقنية هي قابلة للنقاط زمنية تتراوح بين 5 ق ≤ تصل إلى عدة ساعات، وهذا يتوقف على طبيعة العينة microinjected.
Protocol
Discussion
طريقة المقدمة هنا يمكن تسليم مباشرة من البروتينات النقية، الأحماض النووية، أو جزيئات صغيرة حقيقية النواة إلى السيتوبلازم ويتيح فائقة عالية الدقة من خلال تحليل العلاقة من المجهر الفلورسنت والإلكترونات. استخدام هذا الأسلوب هو بسيطة لكنها قوية ويمكن القيام بها في ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء المختبر لإجراء مناقشات مفيدة ألتو. ونشكر أيضا مرفق التصوير الجزيئي والخلوي في UT الطبية مركز جنوب غرب، وتحديدا الدكتور كريس غيلبين، Januszewski توم، ومولر لوري للحصول على الخبرة الفنية والمشورة. نشكر أيضا الدكتور دونغ Xionan لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI083359 لNMA
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
- Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. Advances in microscopy techniques. Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).
- Giepmans, B. N. Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy. Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).
- Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).
- Razi, M., Tooze, S. A. Correlative light and electron microscopy. Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).
- van Weering, J. R. Intracellular membrane traffic at high resolution. Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).
- Polishchuk, R. S. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
- Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).
- Selyunin, A. S. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469, 107-111 (2011).
- Semwogerere, D., Weeks, E. R. . Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).
