CLEM tekniği enjekte edilen moleküller tarafından etkilenen membranlar, organeller ve hücre içi yapıların ultrastrüktürel morfolojisini analiz etmek için adapte edilmiştir. Bu yöntem çok nanometre çözünürlükte milimetre izin mikromanipülasyon / mikroenjeksiyon güçlü teknikleri, konfokal floresan mikroskopi ve elektron mikroskopi birleştirir. Bu teknik, uygulamaların geniş bir çeşitliliği için müsait.
Ökaryotik hücre, kompleks dayanan son derece düzenlenir ve uygun hücre fonksiyonu için gerekli olan biyokimyasal polarite koruma işlevsel farklı membrana bağlı bölmeleri. Enzimler, proteinler ve hücre iskelet yapısı bu biyokimyasal segregasyon yöneten ve bakımını nasıl anlamak büyük önem taşımaktadır. Floresan etiketli moleküllerin kullanımı veya perturb Subselüler bölmeleri bilgi hazinesi vermiştir ve hücresel düzenleme anlayışımızı ilerlemiştir ve / yerelleştirilmesine. Böyle floresan ve konfokal mikroskopi gibi görüntüleme teknikleri nispeten basit bir floresan etiketli küçük molekülün konumunu ascertaining olun, çok küçük yapıların ancak çözünürlük 1 sınırlıdır.
Diğer taraftan, elektron mikroskobu çok yüksek çözünürlükte Subselüler morfoloji detayları ortaya koymuştur, ancak statik doğa zor derece dinamik yanlısı ölçmek için yaparHassas 2,3 ile lerle. Böylece, aynı numunenin elektron mikroskobu, adlandırılır Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) 4,5 ile ışık mikroskobu birleşimi, elektron mikroskobu 6 yüksek çözünürlüklü ultrafast floresan görüntüleme ikili avantajları tanıyor. Bu güçlü teknik hücre biyolojisi 5,7 birçok yönlerini incelemek amacıyla uygulamaya konmuştur. Kuruluşundan bu yana, bu prosedür yüksek çözünürlükte Subselüler mimarileri ve morfolojileri ayırt yeteneğimizi artmıştır.
Burada, CLEM (Şekil 1), ardından hızlı mikroenjeksiyon gerçekleştirilmesi için düzenlenmiş bir yöntem sunulmaktadır. Mikroenjeksiyon CLEM işlem doğrudan ökaryotik hücre sitoplazması içine küçük molekülleri ve / ya da proteinlerin spesifik miktarlarda tanıtmak ve (Şek. 2), çok nm çözünürlüğe kadar milimetre olan etkilerini incelemek için kullanılabilir. Bu teknik, microinjecting dayanmaktadırhücreler hem konfokal floresan ve elektron mikroskobu ile canlı hücre yemekleri ve görüntüleme altına yapıştırılmıştır lazer kazınmış cam gridded lamelleri üzerine büyüdü. İlgi hücre lokalizasyonu (ler) kolaylıkla (Şek. 3) örneklerinin immobilizasyon için kullanılan EPON Reçine, ilgi hücreleri ile birlikte, transfer edilen önceki ve elektron mikroskopi ile analiz kesit bir ızgara deseni ile kolaylaştırılır. Floresan ve EM görüntü Kaplama kullanıcı hücre içi lokalizasyonu hem de ilgi enjekte edilen molekül (Şekil 4) tarafından oluşturulan herhangi bir morfolojik ve / veya yapısal değişikliklerin belirlemesini sağlar. Bu teknik, enjekte edilen örnek doğasına bağlı olarak, birkaç saat ≤ 5 sn kadar değişen zaman noktaları için müsait.
Burada sunulan yöntem ökaryotik sitoplazmaya saflaştırılmış proteinler, nükleik asitler, veya küçük moleküllerin doğrudan teslim edilmesini sağlayan ve floresan ve elektron mikroskobu korelasyon yoluyla ultra yüksek çözünürlük analizi tanıyor. Bu yöntemin kullanılması basit ama sağlam ve çok sayıda mevcut temel tesisleri ve / veya uygun bir alet elektron mikroskopisi laboratuarları ile in-house gerçekleştirilebilir. Tekniği kullanıcının gerçek zamanlı floresan etiketli moleküllerin d…
The authors have nothing to disclose.
Biz yararlı tartışmalar için Alto laboratuar üyelerine teşekkür. Biz de teknik uzmanlık ve danışmanlık için UT Southwestern Tıp Merkezi, özellikle Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, ve Laurie Mueller de Moleküler ve Hücresel Görüntüleme Tesis ederim. Biz de elyazmasının eleştirel okuma için Dr Xionan Dong ederim. Bu çalışma NMA için NIH hibe AI083359 tarafından desteklenmektedir
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |