אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ככלי למדמיינים מולקולות Microinjected והיעדים האיקריוטים תת סלולריים
Summary
טכניקת קלם הותאמה לנתח מורפולוגיה ultrastructural של קרומים, האברונים, ומבני subcellular מושפעים מולקולות microinjected. שיטה זו משלבת טכניקות רבות העצמה של המיקרומניפולציה / microinjection, מיקרוסקופיה confocal ניאון, וכן במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאפשר מילימטר לרזולוציה רבה ננומטר. טכניקה זו היא נוחה למגוון רחב של יישומים.
Abstract
תא האיקריוטים מסתמך על מורכב, פיקוח הדוק, ותאים כפותים קרום תפקודי שונים שישמרו קוטביות צורך ביוכימי לתפקוד תאי תקין. הבנה כיצד אנזימים, חלבונים ורכיבי cytoskeletal למשול ולשמור על פרדה ביוכימי זה היא אפוא בעלת חשיבות עליונה. השימוש במולקולות מתויגות fluorescently למקם ו / או תאים subcellular יפריעו הניבו שפע של ידע וההבנה מתקדמות של רגולציה הסלולרית שלנו. שיטות הדמיה כגון מיקרוסקופיה confocal ניאון ולהפוך את בירור עמדתו של מולקולה מתויגת fluorescently קטנה פשוטה יחסית, עם זאת הרזולוציה של מבנים קטנים מאוד מוגבלת 1.
מצד השני, מיקרוסקופי אלקטרונים חשף פרטים של מורפולוגיה subcellular ברזולוציה גבוהה מאוד, אבל אופי סטטי עושה את זה קשה למדוד פרו דינמי מאודcesses עם דיוק 2,3. לפיכך, שילוב של מיקרוסקופ אור במיקרוסקופ אלקטרונים שלו המדגם, אור גומל כינה ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) 4,5, מעניק את היתרונות הכפולים של הדמית ניאון ultrafast עם הרזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה אלקטרונית 6. טכניקה רבה עצמה זו יושמה כדי ללמוד על היבטים רבים של ביולוגיה של תא 5,7. מאז הקמתה, הליך זה גדל יכולתנו להבחין ארכיטקטורות ומורפולוגיות subcellular ברזולוציה גבוהה.
כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לביצוע microinjection המהיר ובעקבות קלם (1 איור). הליך קלם microinjection ניתן להשתמש כדי להציג את הכמויות ספציפיות של מולקולות קטנות ו / או חלבונים ישירות לתוך הציטופלסמה תא האיקריוטים ולחקור את ההשפעות ממילימטר לרזולוציה רב ננומטר (איור 2). הטכניקה מתבססת על microinjectingתאים גדלו על coverslips הליזר החרוט זכוכית gridded מודבק בתחתית של מנות תא חיים והדמיה עם שניהם מיקרוסקופיה ניאון ואלקטרון confocal. לוקליזציה של התא (הים) של עניין היא בנחייתם של דפוס הרשת, המועבר בקלות, יחד עם התאים של עניין, לשרף EPON משמש לקיבוע של דגימות וחתך לפני הניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים (3 איור). כיסוי של הניאון וEM תמונות מאפשר למשתמש לקבוע את לוקליזציה subcellular כמו גם שינויים מורפולוגיים ו / או ultrastructural הנגרמים על ידי מולקולת microinjected ריבית (איור 4). טכניקה זו היא נוחה לנקודתי זמן שנעו בין 5 ≤ של עד כמה שעות, בהתאם לאופי של מדגם microinjected.
Protocol
Discussion
השיטה שהוצגה כאן מאפשרת העברה הישירה של חלבונים מטוהרים, חומצות גרעין, או מולקולות קטנות לציטופלסמה האיקריוטים ומאפשרת ניתוח אולטרה ברזולוציה גבוהה באמצעות המתאם של מיקרוסקופיה ניאון ואלקטרון. השימוש בשיטה זו הוא פשוט אך חזק וניתן לבצעו בבית עם מתקנים רבים קיימים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת אלטו לדיונים מועילים. אנו מודים גם להדמיה מתקן מולקולרי ותאי במרכז רפואי UT Southwestern, במיוחד ד"ר כריס גילפין, טום Januszewski, וורי מילר למומחיות וייעוץ טכניים. אנו מודים גם לד"ר Xionan דונג לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH AI083359 לNMA
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
- Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. Advances in microscopy techniques. Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).
- Giepmans, B. N. Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy. Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).
- Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).
- Razi, M., Tooze, S. A. Correlative light and electron microscopy. Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).
- van Weering, J. R. Intracellular membrane traffic at high resolution. Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).
- Polishchuk, R. S. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
- Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).
- Selyunin, A. S. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469, 107-111 (2011).
- Semwogerere, D., Weeks, E. R. . Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).
