相关的光学和电子显微镜（CLEM），作为工具来可视化显微注射分子和他们的真核细胞的亚细胞目标
Summary
CLEM技术已被用于分析超微结构形态的细胞膜，细胞器，通过显微注射的分子和亚细胞结构的影响。这种方法结合了强大的技术，的显微/显微注射，共聚焦荧光显微镜，电子显微镜，允许毫米多纳米的分辨率。此技术是适合于各种各样的应用。
Abstract
依赖于复杂的真核细胞中，高稳定，功能不同的膜结合隔间保持必要的生化极性适当的细胞功能。因此，了解的酶，蛋白质和细胞骨架，治理和维护这种生化分离是非常重要的。使用荧光标记的分子定位和/或扰乱细胞内的车厢已经取得了丰富的知识和先进的细胞调控的认识。荧光和共聚焦显微镜成像技术，如确定一个荧光标记的小分子相对简单的位置，但是分辨率非常小的结构受限情况说明1。
另一方面，电子显微镜揭示了亚细胞形态的细节，以非常高的分辨率，但它的静态特性使得它难以衡量的高度动态的亲精度2,3 cesses用。因此，光显微镜和电子显微镜对同一样品，被称为的相关光学和电子显微镜（CLEM）4,5的组合，能提供超快荧光成像的双重优点，高分辨率的电子显微镜6。这种强大的技术已经实施，以研究细胞生物学的许多方面的5,7。公司自成立以来，这个过程增加了我们的辨别能力，在高分辨率下的亚细胞结构和形态。
在这里，我们提出了一种简化的方法进行快速显微注射，其次是CLEM（ 图1）。显微注射的CLEM程序可以使用，引入特定数量的小分子和/或蛋白直接进入真核细胞的细胞质中，研究了从毫米到纳米多分辨率（ 图2）。该技术是基于显微注射细胞生长的激光蚀刻玻璃网格底部的活细胞菜肴和成像，共聚焦荧光和电子显微镜的盖玻片贴。容易的格子图案，这是很容易转移，以及所关注的细胞，EPON用于固定样品的树脂切片前的电子显微镜分析（ 图3）的细胞的本地化（s）的权益。叠加的荧光灯和EM的图像允许用户确定的亚细胞定位，以及任何形态和/或超微结构的变化引起的显微注射分子的利益（ 图4）。此技术是适合从≤5 s到几个小时，取决于的显微注射样品的性质上的时间点。
Protocol
Discussion
这里介绍的方法能够直接提供纯化的蛋白质，核酸，小分子真核细胞的细胞质中，通过荧光显微镜和电子显微镜的相关性，并能提供超高分辨率分析。使用这种方法是简单而强大的，可以在内部进行，与许多现有的核心设施和/或适当配备的电子显微镜实验室。该技术也适合于活细胞，允许用户监视的动态实时荧光标记的分子，从而可以使用的时间推移显微镜和相关的断层电子显微镜。
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢的Alto实验室的有益讨论。我们也感谢德州大学西南医学中心，特别是克里斯·吉尔平博士，汤姆雅努谢夫斯基，和劳里·穆勒的分子和细胞成像设备在专业知识和咨询。我们也感谢Xionan董批判性阅读的手稿。支持这项工作是由美国国立卫生研究院授予AI083359 NMA
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
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