Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer
Summary
De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.
Abstract
De eukaryote cel steunt op complexe, sterk gereguleerd en functioneel verschillende membraan gebonden compartimenten die een biochemische polariteit noodzakelijk te bewaren voor een goede cellulaire functie. Begrijpen hoe de enzymen, eiwitten, en het cytoskelet componenten besturen en onderhouden van deze biochemische scheiding is dan ook van het grootste belang. Het gebruik van fluorescent gelabeld moleculen te lokaliseren en / of verstoren subcellulaire compartimenten heeft een schat aan kennis en ons begrip van cellulaire regelgeving. Beeldvormingstechnieken zoals fluorescente confocale microscopie en maakt bepaling van de positie van een fluorescent gelabeld kleine molecule relatief eenvoudig, is echter de resolutie van zeer kleine beperkt 1.
Anderzijds heeft elektronenmicroscopie details bekend van subcellulaire morfologie bij zeer hoge resolutie, maar de statische aard is het moeilijk te meten zeer dynamische proprocessen met precisie 2,3. Dus de combinatie van lichtmicroscopie met elektronenmicroscopie van hetzelfde monster, genoemd Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) 4,5, biedt de dubbele voordelen van ultrasnelle fluorescente beeldvorming met de hoge resolutie van elektronenmicroscopie 6. Deze krachtige techniek is geïmplementeerd om vele aspecten van celbiologie 5,7 bestuderen. Sinds haar oprichting heeft deze procedure vergroot ons vermogen om subcellulaire architecturen en morfologie met een hoge resolutie te onderscheiden.
Hier geven we een gestroomlijnde werkwijze voor het uitvoeren snel gevolgd door micro-injectie CLEM (Fig. 1). De microinjectie CLEM procedure kan worden gebruikt om bepaalde hoeveelheden kleine moleculen en / of eiwitten rechtstreeks in de eukaryote cel cytoplasma en onderzoeken de effecten van millimeter tot meerdere nanometer resolutie (Fig. 2). De techniek is gebaseerd op microinjectingcellen gekweekt op laser geëtst glas gerasterde dekglaasjes aan de onderkant van levende cellen gerechten en imaging zowel confocale fluorescente en elektronenmicroscopie. Lokalisatie van de cel (len) plaats wordt vergemakkelijkt door het rasterpatroon, dat gemakkelijk wordt, overgebracht samen met de cellen van belang, de EPON hars gebruikt voor immobilisatie van monsters en snijden voor elektronenmicroscopie analyse (Fig. 3). Overlay van fluorescerende en EM foto laat de gebruiker toe om de subcellulaire lokalisatie alsmede morfologische en / of ultrastructurele veranderingen geïnduceerd door de microgeïnjecteerde molecule plaats (Fig. 4). Deze techniek is ontvankelijk voor tijdstippen van ≤ 5 s tot enkele uren, afhankelijk van de aard van de microgeïnjecteerde monster.
Protocol
Discussion
Werkwijze hier gepresenteerde maakt de directe levering van gezuiverde eiwitten, nucleïnezuren of kleine moleculen van de eukaryote cytoplasma en biedt ultrahoge resolutie analyse door de correlatie van fluorescerende en elektronenmicroscopie. Het gebruik van deze methode is eenvoudig maar toch robuust en kan worden uitgevoerd in eigen huis met veel bestaande kern faciliteiten en / of op de juiste wijze voorzien van elektronenmicroscopie labs. De techniek is ontvankelijk voor levende cellen, zodat de gebruiker de dynam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de Alto laboratorium voor nuttige discussies. We danken ook de moleculaire en cellulaire beeldvorming Facility aan de UT Southwestern Medical Center, in het bijzonder Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, en Laurie Mueller voor technische expertise en advies. We danken ook Dr Xionan Dong voor kritisch lezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie AI083359 naar NMA
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
- Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. Advances in microscopy techniques. Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).
- Giepmans, B. N. Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy. Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).
- Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).
- Razi, M., Tooze, S. A. Correlative light and electron microscopy. Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).
- van Weering, J. R. Intracellular membrane traffic at high resolution. Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).
- Polishchuk, R. S. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
- Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).
- Selyunin, A. S. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469, 107-111 (2011).
- Semwogerere, D., Weeks, E. R. . Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).
