Korrelat ljus-och elektronmikroskopi (FÖRHUNGRA) som ett verktyg för att visualisera mikroinjiceras molekyler och deras Eukaryota Sub-cellulära mål
Summary
Den FÖRHUNGRA Tekniken har anpassats för att analysera ultrastrukturella morfologi av membran, organeller och subcellulära strukturer som berörs av mikroinjicerade molekyler. Denna metod kombinerar de kraftfulla tekniker för mikromanipulering / mikroinjektion, konfokal fluorescensmikroskopi, och elektronmikroskopi att tillåta millimeter till flera nanometer upplösning. Denna teknik är mottaglig för en mängd olika tillämpningar.
Abstract
Den eukaryota cellen bygger på komplexa, starkt reglerad, och funktionellt distinkta membranbundna fack som bevarar en biokemisk polaritet nödvändig för korrekt cellulär funktion. Förstå hur enzymer, proteiner och cytoskelettala komponenter styr och upprätthåller denna biokemiska segregering är därför av största vikt. Användningen av fluorescerande taggade molekyler att lokalisera och / eller störa subcellulära fack har gett en mängd kunskap och avancerade vår förståelse av cellulär reglering. Avbildningstekniker såsom fluorescerande och konfokalmikroskopi gör fastställa positionen för en fluorescent märkt liten molekyl relativt okomplicerad, är dock upplösningen av mycket små strukturer begränsad 1.
Å andra sidan, har elektronmikroskopi avslöjade detaljer om subcellulär morfologi vid mycket hög upplösning, men dess statiska karaktär gör det svårt att mäta mycket dynamisk proprocesser med precision 2,3. Sålunda ger kombinationen av Ijusmikroskopi med elektronmikroskopi av samma prov, benämnd Korrelat ljus-och elektronmikroskopi (FÖRHUNGRA) 4,5, de dubbla fördelarna med ultrasnabb fluorescerande avbildning med hög upplösning av elektronmikroskopi 6. Denna kraftfulla teknik har genomförts för att studera många aspekter av cellbiologi 5,7. Sedan starten har detta förfarande ökat vår förmåga att skilja subcellulära arkitekturer och morfologier med hög upplösning.
Här presenterar vi en strömlinjeformad metod för att utföra en snabb mikroinjektion följt av FÖRHUNGRA (Fig. 1). Mikroinjektion FÖRHUNGRA Förfarandet kan användas för att införa särskilda mängder av små molekyler och / eller proteiner direkt in i eukaryota cellens cytoplasma och studera effekterna av millimeter till flera nanometer upplösning (Fig. 2). Tekniken är baserad på microinjectingceller odlas på laser etsat glas rutindelade täckglas som sitter på undersidan av levande celler rätter och bildhantering med både konfokal fluorescerande och elektronmikroskopi. Lokalisering av cellen (er) av intresse underlättas av rutnätsmönstret, som lätt överförs, tillsammans med cellerna av intresse, till Epon harts som användes för immobilisering av prover och sektionering före elektronmikroskopi analys (fig. 3). Överlagring av fluorescerande och EM bilder låter användaren bestämma subcellulära lokalisering samt eventuella morfologiska och / eller ultrastrukturella förändringar inducerade av mikroinjicerade molekylen av intresse (bild 4). Denna teknik är mottaglig för tidpunkter varierande från ≤ 5 s upp till flera timmar, beroende på typen av mikroinjicerade provet.
Protocol
Discussion
Den metod som presenteras här möjliggör direkt leverans av renade proteiner, nukleinsyror, eller små molekyler till eukaryota cytoplasman och ger extremt hög upplösning analys genom korrelationen av fluorescerande och elektronmikroskopi. Användningen av denna metod är enkel men robust och kan utföras i egen regi med många befintliga core faciliteter och / eller med lämplig utrustning elektron laboratorier mikroskopi. Tekniken är också mottaglig för levande celler, så att användaren kan övervaka dynamike…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar i Alto laboratorium för hjälp diskussioner. Vi tackar också de molekylära och cellulära Imaging Facility vid UT Southwestern Medical Center, särskilt Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, och Laurie Mueller för teknisk expertis och rådgivning. Vi tackar också Dr Xionan Dong för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöds av NIH bidrag AI083359 till NMA
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
- Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. Advances in microscopy techniques. Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).
- Giepmans, B. N. Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy. Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).
- Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).
- Razi, M., Tooze, S. A. Correlative light and electron microscopy. Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).
- van Weering, J. R. Intracellular membrane traffic at high resolution. Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).
- Polishchuk, R. S. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
- Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).
- Selyunin, A. S. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469, 107-111 (2011).
- Semwogerere, D., Weeks, E. R. . Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).
