Lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM) comme un outil pour visualiser des molécules et de leurs microinjecté eucaryotes Sous-cellulaires cibles
Summary
La technique CLEM a été conçu pour analyser la morphologie ultrastructurale des membranes, les organites subcellulaires, et des structures affectées par micro-injection des molécules. Cette méthode combine les techniques puissantes de micromanipulation / microinjection, microscopie confocale à fluorescence et microscopie électronique pour permettre millimètre à résolution nanométrique multi-. Cette technique se prête à une grande variété d'applications.
Abstract
La cellule eucaryote dépend complexe, très réglementé, et fonctionnellement distinctes compartiments membranaires liés à préserver une polarité biochimique nécessaire à la fonction cellulaire adéquate. Comprendre comment les enzymes, les protéines et les composants du cytosquelette gouverner et maintenir cette séparation biochimique est donc d'une importance primordiale. L'utilisation de molécules marquées par fluorescence de localiser et / ou perturbent compartiments subcellulaires a révélé une mine de connaissances et de faire progresser notre compréhension de la régulation cellulaire. Les techniques d'imagerie telles que la microscopie confocale fluorescente et faire déterminer la position d'une molécule fluorescente marqués petite relativement simple, mais la résolution de très petites structures est limitée 1.
D'autre part, la microscopie électronique a révélé les détails de la morphologie subcellulaire à très haute résolution, mais son caractère statique, il est difficile de mesurer très dynamique processus avec précision 2,3. Ainsi, la combinaison de la microscopie optique à la microscopie électronique d'un même échantillon, appelé Lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM) 4,5, offre le double avantage de l'imagerie de fluorescence ultra-rapide avec la haute résolution de la microscopie électronique 6. Cette technique puissante a été mis en place pour étudier de nombreux aspects de 5,7 biologie cellulaire. Depuis sa création, cette procédure a accru notre capacité à distinguer les architectures subcellulaires et des morphologies à haute résolution.
Ici, nous présentons une méthode simplifiée pour la réalisation de micro-injection rapide suivie d'CLEM (Fig. 1). La procédure CLEM micro-injection peut être utilisé pour introduire des quantités spécifiques de petites molécules et / ou des protéines directement dans le cytoplasme de cellules eucaryotes et étudier les effets du millimètre à plusieurs nanomètres résolution (Fig. 2). La technique est basée sur la micro-injectioncellules cultivées sur des lamelles en verre gravé au laser par maille fixé au fond de vaisselle de cellules vivantes et l'imagerie par microscopie confocale à la fois fluorescent et d'électrons. Localisation de la cellule (s) d'intérêt est facilitée par la configuration de grille, qui est facilement transférable, avec des cellules d'intérêt, de la résine Epon utilisé pour l'immobilisation des échantillons et de sectionnement avant analyse par microscopie électronique (fig. 3). Superposition des images fluorescentes et EM permet à l'utilisateur de déterminer la localisation subcellulaire ainsi que les modifications morphologiques et / ou ultrastructurales induites par la molécule d'intérêt microinjecté (Fig. 4). Cette technique se prête à des points de temps allant de ≤ 5 s jusqu'à plusieurs heures, selon la nature de l'échantillon microinjectés.
Protocol
Discussion
La méthode présentée ici permet la livraison directe des protéines, des acides nucléiques purifiés, ou des petites molécules dans le cytoplasme eucaryote et offre ultra-haute résolution grâce à l'analyse de la corrélation de la microscopie à fluorescence et électronique. L'utilisation de cette méthode est simple mais robuste et peut être réalisée en interne avec de nombreuses installations de base existantes et / ou des laboratoires convenablement équipés en microscopie électronique. La techn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Alto pour des discussions utiles. Nous remercions également le Fonds pour l'imagerie moléculaire et cellulaire à l'UT Southwestern Medical Center, en particulier le Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, et Laurie Mueller pour l'expertise technique et des conseils. Nous remercions également le Dr Dong Xionan pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail est soutenu par le NIH subvention AI083359 à NMA
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
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