Summary

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets

Published: May 04, 2012
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Summary

Die CLEM Technik angepasst worden, um ultrastrukturelle Morphologie der Membranen, Organellen und subzelluläre Strukturen mikroinjizierten Moleküle beeinflusst analysieren. Diese Methode kombiniert die leistungsstarke Techniken der Mikromanipulation / Mikroinjektion, konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu ermöglichen Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Diese Technik ist zugänglich für eine breite Vielzahl von Anwendungen.

Abstract

Die eukaryotische Zelle beruht auf komplexen, stark regulierten und funktionell unterschiedlichen membrangebundene Kompartimente eine biochemische Polarität notwendig für korrekte zelluläre Funktion zu bewahren. Verstehen, wie die Enzyme, Proteine ​​und Zytoskelett-Komponenten und regeln pflegen diese biochemischen Segregation ist daher von größter Bedeutung. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Moleküle und / oder stören subzellulären Kompartimenten hat eine Fülle von Wissen nachgegeben und zu unserem Verständnis der zellulären Regulation lokalisieren. Bildgebende Verfahren wie fluoreszierende und konfokale Mikroskopie machen Ermittlung der Position eines fluoreszierend markierten Kleinmolekül relativ einfach, jedoch wird die Auflösung des sehr kleinen Strukturen 1 begrenzt.

Auf der anderen Seite hat Elektronenmikroskopie Einzelheiten subzellulären Morphologie bei sehr hoher Auflösung offenbart, sondern seine statische Natur erschwert hochdynamischen Pro messenProzesse mit Präzision 2,3. So ergibt die Kombination von Lichtmikroskopie mit Elektronenmikroskopie der gleichen Probe, genannt Korrelative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, die zwei Vorteile ultraschnellen Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher Auflösung der Elektronenmikroskopie 6. Diese leistungsstarke Technik wurde eingeführt, um viele Aspekte der Zellbiologie 5,7 studieren. Seit seiner Gründung hat sich dieses Verfahren unsere Fähigkeit zur subzellulären Architekturen und Morphologien in hoher Auflösung zu unterscheiden erhöht.

Hier präsentieren wir eine optimierte Methode zur raschen Durchführung Mikroinjektion von CLEM (Abb. 1) gefolgt. Die Mikroinjektion CLEM Verfahren kann verwendet werden, um bestimmte Mengen von kleinen Molekülen und / oder Proteine ​​direkt in der eukaryotischen Zelle Zytoplasma einzuführen und die Wirkungen von Millimeter zu Multi-Nanometer-Auflösung (Abb. 2). Die Technik basiert auf der Grundlage MikroinjizierenZellen auf Laser Ätzglas gerasterten Deckgläser befestigt an der Unterseite der Lebendzelldichte Geschirr und Bildgebung sowohl konfokale Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie gewachsen. Lokalisierung der Zelle (n) von Interesse vom Gittermuster, die leicht übertragen wird, zusammen mit den Zellen von Interesse zur Epon Harz zur Immobilisierung von Proben verwendet und Schaltstellen vor elektronenmikroskopische Analyse (Abb. 3) erleichtert. Überlagerung von Fluoreszenz-und EM-Bilder ermöglicht dem Benutzer, die subzelluläre Lokalisation sowie jegliche morphologischen und / oder ultrastrukturelle Veränderungen durch die mikroinjizierten Molekül von Interesse (Abb. 4) induziert wird. Diese Technik ist zugänglich Zeitpunkten von ≤ 5 s bis zu einigen Stunden, abhängig von der Natur des mikroinjizierten Probe.

Protocol

Ein. Mammalian Cell Culture Normale Rattenniere (NRK), immortalisierten Gebärmutterhalskrebs (HeLa) oder andere geeignete Säugerzelllinien werden bei 37 ° C, 5% CO 2, unter photogeätzten Glas gerasterten Deckgläser befestigten Geschirr Zelle lebt (siehe Tabelle 1 für jede Reagenz oder Vorrichtung in diesem Protokoll verwendet) in DMEM + 10% FBS und 1% Pen / Strep. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um eine sterile Umgebung beizubehalten, wenn die Arbeit mit kultivierte…

Discussion

Das hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die direkte Abgabe des gereinigten Proteinen, Nukleinsäuren, oder kleinen Molekülen an die eukaryotischen Zytoplasma und liefert ultrahochauflösende Analyse durch die Korrelation von fluoreszierenden und Elektronenmikroskopie. Die Anwendung dieser Methode ist einfach, aber robust und kann in-house mit vielen bestehenden Core Facilities und / oder entsprechend ausgestattete Elektronenmikroskopie Labors durchgeführt werden. Die Technik eignet sich auch, um Live-Zelle, so das…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Mitglieder der Alto Labor für hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch der molekularen und zellulären Imaging Facility am UT Southwestern Medical Center, speziell Dr. Chris Gilpin, Tom Januszewski und Laurie Mueller für technische Kompetenz und Beratung. Wir danken auch Dr. Xionan Dong für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wird durch NIH AI083359 um NMA unterstützt

Materials

Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments
Photoetched Coverslip and Live-cell Plate MatTek P35G-2-14-CGRD  
Texas Red Invitrogen D3329  
Cascade Blue Invitrogen D7132  
Rhodamine Labeling Kit Thermo Scientific 53002  
0.22 μm centrifugal filtration unit Millipore UFC30GV00  
Borosilicate Glass Pipettes Sutter Instruments BF100-50-10  
Micropipette Puller Sutter Instruments Model P-97 Use program #4 after performing ramp test
FemtoJet Microinjection System Eppendorf Injectman NI2  
Coverslip Removal Fluid MatTek PDCF OS 30  
Technai Transmission Electron Microscope FEI Technai G2 BioTWIN  
Ultramicrotombe Leica EM UC6  

References

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Cite This Article
Reddick, L. E., Alto, N. M. Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets. J. Vis. Exp. (63), e3650, doi:10.3791/3650 (2012).

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