Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets
Summary
Die CLEM Technik angepasst worden, um ultrastrukturelle Morphologie der Membranen, Organellen und subzelluläre Strukturen mikroinjizierten Moleküle beeinflusst analysieren. Diese Methode kombiniert die leistungsstarke Techniken der Mikromanipulation / Mikroinjektion, konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu ermöglichen Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Diese Technik ist zugänglich für eine breite Vielzahl von Anwendungen.
Abstract
Die eukaryotische Zelle beruht auf komplexen, stark regulierten und funktionell unterschiedlichen membrangebundene Kompartimente eine biochemische Polarität notwendig für korrekte zelluläre Funktion zu bewahren. Verstehen, wie die Enzyme, Proteine und Zytoskelett-Komponenten und regeln pflegen diese biochemischen Segregation ist daher von größter Bedeutung. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Moleküle und / oder stören subzellulären Kompartimenten hat eine Fülle von Wissen nachgegeben und zu unserem Verständnis der zellulären Regulation lokalisieren. Bildgebende Verfahren wie fluoreszierende und konfokale Mikroskopie machen Ermittlung der Position eines fluoreszierend markierten Kleinmolekül relativ einfach, jedoch wird die Auflösung des sehr kleinen Strukturen 1 begrenzt.
Auf der anderen Seite hat Elektronenmikroskopie Einzelheiten subzellulären Morphologie bei sehr hoher Auflösung offenbart, sondern seine statische Natur erschwert hochdynamischen Pro messenProzesse mit Präzision 2,3. So ergibt die Kombination von Lichtmikroskopie mit Elektronenmikroskopie der gleichen Probe, genannt Korrelative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, die zwei Vorteile ultraschnellen Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher Auflösung der Elektronenmikroskopie 6. Diese leistungsstarke Technik wurde eingeführt, um viele Aspekte der Zellbiologie 5,7 studieren. Seit seiner Gründung hat sich dieses Verfahren unsere Fähigkeit zur subzellulären Architekturen und Morphologien in hoher Auflösung zu unterscheiden erhöht.
Hier präsentieren wir eine optimierte Methode zur raschen Durchführung Mikroinjektion von CLEM (Abb. 1) gefolgt. Die Mikroinjektion CLEM Verfahren kann verwendet werden, um bestimmte Mengen von kleinen Molekülen und / oder Proteine direkt in der eukaryotischen Zelle Zytoplasma einzuführen und die Wirkungen von Millimeter zu Multi-Nanometer-Auflösung (Abb. 2). Die Technik basiert auf der Grundlage MikroinjizierenZellen auf Laser Ätzglas gerasterten Deckgläser befestigt an der Unterseite der Lebendzelldichte Geschirr und Bildgebung sowohl konfokale Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie gewachsen. Lokalisierung der Zelle (n) von Interesse vom Gittermuster, die leicht übertragen wird, zusammen mit den Zellen von Interesse zur Epon Harz zur Immobilisierung von Proben verwendet und Schaltstellen vor elektronenmikroskopische Analyse (Abb. 3) erleichtert. Überlagerung von Fluoreszenz-und EM-Bilder ermöglicht dem Benutzer, die subzelluläre Lokalisation sowie jegliche morphologischen und / oder ultrastrukturelle Veränderungen durch die mikroinjizierten Molekül von Interesse (Abb. 4) induziert wird. Diese Technik ist zugänglich Zeitpunkten von ≤ 5 s bis zu einigen Stunden, abhängig von der Natur des mikroinjizierten Probe.
Protocol
Discussion
Das hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die direkte Abgabe des gereinigten Proteinen, Nukleinsäuren, oder kleinen Molekülen an die eukaryotischen Zytoplasma und liefert ultrahochauflösende Analyse durch die Korrelation von fluoreszierenden und Elektronenmikroskopie. Die Anwendung dieser Methode ist einfach, aber robust und kann in-house mit vielen bestehenden Core Facilities und / oder entsprechend ausgestattete Elektronenmikroskopie Labors durchgeführt werden. Die Technik eignet sich auch, um Live-Zelle, so das…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitglieder der Alto Labor für hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch der molekularen und zellulären Imaging Facility am UT Southwestern Medical Center, speziell Dr. Chris Gilpin, Tom Januszewski und Laurie Mueller für technische Kompetenz und Beratung. Wir danken auch Dr. Xionan Dong für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wird durch NIH AI083359 um NMA unterstützt
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
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