도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법
Summary
클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.
Abstract
진핵 세포는 복잡한에 의존 높은 규제하고, 적절한 세포 기능에 필요한 생화학 극성을 보존 기능 뚜렷한 막 바인딩 된 구획. 효소, 단백질, 그리고 cytoskeletal 부품이 생화학 분리를 적용하고 유지하는 방법을 이해하는 것은 파라마운트 중요성을 따라서입니다. 휘황 태그 분자의 사용 또는 교란 subcellular 구획은 풍부한 지식이 나왔고 및 셀룰러 규제에 대한 우리의 이해를 전진했다와 / 현지화입니다. 이러한 형광 및 공 촛점 현미경 등의 이미징 기술은 비교적 간단 휘황 태그 작은 분자의 위치를 ascertaining 수 있도록 매우 작은 구조 그러나 해상도는 1 제한됩니다.
한편, 전자 현미경은 매우 높은 해상도로 subcellular 형태의 세부 사항을 발표했다 있지만 정적 자연은 어려운 매우 동적 프로를 측정 할 수 있습니다정밀도 2,3와 cesses. 따라서, 동일한 샘플의 전자 현미경, 칭했다 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인) 4,5과 빛 현미경의 조합은, 전자 현미경 6 높은 해상도로 ultrafast 형광 이미징의 듀얼 장점을 갖게. 이 강력한 기술은 세포 생물학 5,7의 여러 측면을 연구 구현되었습니다. 처음 소개 된 이래,이 절차는 높은 해상도의 subcellular 구조와 morphologies를 구별 할 수있는 능력을 향상 시켰습니다.
여기, 우리는 클레멘 타인 (그림 1) 다음 빠른 microinjection을 수행하기위한 간소화 된 방법을 제시한다. microinjection의 클레멘 타인 절차는 직접 진핵 세포 세포질에 작은 분자 및 / 또는 단백질의 특정 수량을 소개하고 (그림 2) 멀티 나노 미터 해상도 mm의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 기술은 microinjecting을 기반으로합니다세포는 모두 공 촛점 형광 및 전자 현미경과 라이브 셀 요리와 이미지의 하단에 부착 레이저 에칭 유리 gridded coverslips에 성장. 관심 세포의 현지화 (들) 쉽게 (그림 3) 시료의 고정에 사용되는 Epon 수지에 이르기까지 관심의 세포와 함께 양도 및 이전 전자 현미경 분석에 sectioning되는 격자 패턴에 의해 촉진된다. 형광 및 EM 이미지의 중첩은 사용자가 subcellular 지방화뿐만 아니라 관심 microinjected 분자 (그림 4)에 의해 유도 된 형태학 및 / 또는 ultrastructural 변경 사항을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 microinjected 샘플의 특성에 따라 몇 시간이 ≤에서 5 초를 이르는 시간이 가리키는 의무가 있습니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시된 방법은 진핵 세포 세포질에 정화 단백질, 핵산, 또는 작은 분자의 직접 전송을 할 수 있으며 형광 및 전자 현미경의 상관 관계를 통해 초 고해상도 분석을 갖게. 이 방법의 사용은 단순하지만 강력한이 많은 기존의 핵심 시설 및 / 또는 적절하게 구비 전자 현미경 실험실와 함께 집에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 사용자가 실시간으로 휘황 태그 분자의 역학을 모니터링 할 수 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 토론의 알토 연구소의 회원 감사드립니다. 우리는 또한 기술적 인 전문 지식과 조언을 UT 남서 의료 센터, 특히 박사 크리스 Gilpin, 톰 Januszewski, 그리고 로리 뮬러에서 분자 및 세포 이미징 시설 감사드립니다. 우리는 또한 원고의 중요한 읽기에 대한 박사 Xionan 동 감사드립니다. 이 작품은 NMA에 NIH 보조금 AI083359에서 지원
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
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