Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas
Summary
A técnica CLEM foi adaptado para analisar a morfologia ultraestrutural de membranas, organitos e estruturas subcelulares afectados por moléculas microinjectados. Este método combina as técnicas poderosas de micromanipulação / microinjeção, microscopia confocal, fluorescentes e microscopia eletrônica para permitir milímetros de multi-resolução nanométrica. Esta técnica é susceptível a uma grande variedade de aplicações.
Abstract
A célula eucariótica depende complexo, altamente regulado, e compartimentos da membrana acoplados funcionalmente distintos que preservam a polaridade bioquímico necessário para a função celular adequada. Entender como as enzimas, proteínas e componentes do citoesqueleto governar e manter esta segregação bioquímica é, portanto, de suma importância. A utilização de moléculas fluorescentes marcadas para localizar e / ou perturbam compartimentos subcelulares rendeu uma riqueza de conhecimentos e avanços na compreensão da regulação celular. Técnicas de imagiologia tais como a microscopia de fluorescência confocal e fazer a determinar a situação de uma molécula fluorescente etiquetado pequeno relativamente simples, no entanto a resolução de estruturas muito pequenas é limitada 1.
Por outro lado, a microscopia electrónica revelou detalhes da morfologia subcelular com resolução muito elevada, mas a sua natureza estática torna mais difícil de medir pró altamente dinâmicosos com precisão 2,3. Assim, a combinação de microscopia de luz por microscopia de electrões de uma mesma amostra, denominado microscópio óptico e electrões (CLEM) 4,5, proporciona as vantagens duplas de ultra imagem fluorescente com a alta resolução de microscopia electrónica de 6. Esta poderosa técnica foi implementada para estudar vários aspectos da biologia celular 5,7. Desde a sua criação, este procedimento tem aumentado a nossa capacidade de distinguir arquiteturas subcelulares e morfologias em alta resolução.
Aqui, apresentamos um método simplificado para a realização de microinjeção rápida seguida de CLEM (Fig. 1). O procedimento CLEM microinjecção pode ser utilizado para introduzir quantidades específicas de moléculas pequenas e / ou proteínas directamente para o citoplasma da célula eucariótica e estudar os efeitos de milímetro a nanometros de multi-resolução (Fig. 2). A técnica baseia-se na microinjectingcélulas cultivadas em lamínulas gravadas a laser de vidro grade aposta para o fundo de pratos de células vivas e de imagem com tanto microscopia confocal fluorescente e eletrônica. Localização da célula (s) de interesse é facilitado pelo padrão de grade, a qual é facilmente transferido, juntamente com as células de interesse, para a resina Epon utilizado para imobilização de amostras e de corte antes da análise por microscopia de electrões (fig. 3). Sobreposição de imagens de fluorescência e EM permite ao utilizador determinar a localização subcelular, assim como quaisquer alterações morfológicas e / ou induzidos por ultra-estrutural da molécula de interesse microinjectados (Fig. 4). Esta técnica é passível de pontos de tempo variando de ≤ 5 s até várias horas, dependendo da natureza da amostra microinjectados.
Protocol
Discussion
O método aqui apresentado permite a entrega directa de proteínas purificadas, ácidos nucleicos, ou moléculas pequenas para o citoplasma eucariótico e permite a análise de alta resolução ultra através da correlação de microscopia de fluorescência e de electrões. A utilização deste método é simples e robusto e pode ser realizado in-house com muitas instalações nucleares existentes e / ou laboratórios adequadamente equipados de microscopia electrónica. A técnica é também passível de live-célula, q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a membros do laboratório Alto para discussões úteis. Agradecemos também a Facilidade Imagem Molecular e Celular da UT Southwestern Medical Center, especificamente o Dr. Chris Gilpin, Januszewski Tom, e Mueller Laurie para perícia técnica e aconselhamento. Agradecemos também o Dr. Xionan Dong para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo NIH concessão AI083359 a NMA
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
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