Summary
마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를 정의
Abstract
; utricle 및 saccule의 maculae 및 코일 달팽이관에 Corti의 기관 반원의 운하 ampullae 3 cristae : 포유류의 내이 (内耳)는 6 독특한 감각 상피 조직이 있습니다. cristae와 maculae은 Corti의 기관에서 청각 세포가 1 청각의 기본 트랜스 듀서 반면 기계적 자극이 균형의 특별한 감각을 보조하다 할 transduce vestibular 세포가 포함되어 있습니다. 반원의 운하와 달팽이관 이러한 감각 상피 조직과 morphogenesis의 세포 운명 사양은 마우스의 태동의 두 번째 주 동안 자리를 대신하고 대부분이 출산 2,3 전에 완료됩니다. 마우스 내이 (内耳)의 발달 연구는 정기적으로 세포 및 / 또는 형태학의 phenotypes 4,5의 분자 기초에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 배아 또는 출생 후의 단계에서 유전자 변형 배아를 수확하여 실시하고 있습니다. 우리는 utero의 발전 마우스 내이 (内耳)에 해당 유전자 전달 가설 </ em>는 이득과 손실의 기능 연구의 맥락에서 포유류의 내이 (内耳)의 개발 6 밑에있는 유전자 메커니즘의 심문에 대한 전통적인 마우스 transgenesis에 대한 무료 접근 방식을 나타냅니다.
복부 개복술 1), 2) transuterine microinjection 및 생체내의 electroporation 3) : 개발 마우스 내이 (内耳)에 유전자 misexpression 연구를 실시하는 실험적 패러다임 여기서 보여주 세 일반적인 단계로 해결됩니다. 복부 개복술은 이식 배아 7 실험적 액세스할 자궁 externalization를 허용 마우스 생존 수술 기법입니다. Transuterine microinjection은 귀의 소포 또는 otocyst의 루멘에 플라스미드 표현을 소개 beveled, 유리 모세관 micropipettes의 사용이다. 생체내에 electroporation은 전구 세포의 8-10로 플라스미드 표현을 운전 사각 파, 직류 펄스의 응용 프로그램입니다.
11의 각 단계에 대한 상세한 기록이 포함되어 있습니다. 마우스 실험 embryological 기술은 산문에서 배우고 스틸 이미지 혼자하기 어려울 수 있습니다. 현재 직장에서 우리는 유전자 전달 절차의 3 단계를 보여줍니다. 대부분 비판적으로, 우리는 방법 정확하게 표시하는 디지털 비디오 현미경을 배포 : 1) utero에서 배아 방향을 파악, 2) otocyst에 주사를 타겟팅을위한 배아를 방향, 3) 배아 일 11.5에서 otocyst로 추적 염료 용액과 혼합 DNA를 microinject과 12.5, 출생에서 출생 후의 선택과 5) 라벨 electroporated 배아, 4) 주입 otocyst을 electroporate. 일반적인 방법론적인 오류를 방지하는 방법을 논의; otocyst mistargeting의 가장 일반적인 원인에 그림 가이드, 우리는 성공적으로 transfected 안쪽 귀의 대표적인 예제를 제공하고 utero g에 쓰기 위해 현재 지침에너지 전송 동물 케어 프로토콜.
Protocol
1. 복부 개복술
- 나트륨 pentobarbital 마취 용액 (g 체중 당 7.5 μL)의 intraperitoneal 주사에 의한, 누구의 배아 배아 일 11.5 (질 플러그인이 감지 당일 정오가 배아 발달의 일 0.5입니다 E11.5)에있는 댐을 마취. 마취 용액 근무 :; 절대 에탄올 100 μL, 65 밀리그램 / ML 수성 마그네슘 황산 (자궁 음색을 modulates) 320 μL, 50 밀리그램 / ML pentobarbital 나트륨 용액 180 μL 및 프로필렌 글리콜 400 μL (와 차량 miscible을 수용액 및 유기 구성 요소).
- 유해 자극 테스트를 실시하여 마취의 완전성을 평가 : 발자국 조르기, 꼬리 핀치, 뺨 및 vibrissae 터치 및 깜박임 반응. 각막에 무균 안과 연고를 바릅니다.
- suprapubic 지역에서 가위로 흉곽과 훌륭한 블레이드 (Oster # 40 칼날)로 복부 모피 면도. 70 % 에탄올과 복부, 10 % povidone의 요오드 (Betadine)를 소독차 70 % 에탄올, 순차적으로. 장소는 무균 드레이프에서 마우스 복부 쪽 아래로 누른 다음 2-5 분을위한 가열 패드 또는 따뜻한 플레이트 (37 ° C)에서 설정합니다.
- 공 - 스쳐 가위로 복부 중간선에서 복부 피부를 절개하다. 10~14mm에 대한 절개를 확장합니다. linea 알바, 복부 벽 배면의 중간선을 따라 avascular, 흰색 결합 조직 밴드를 식별합니다. 공이 가위 밀고로 linea 알바를 절개하고 절개 10~14밀리미터을 확장. 즉시 prewarmed (37 ° C) lactated 울리는의 솔루션으로 복부를 관개하다.
- 주입 사이트에 과도한 압력을 적용하지 않고 고리 집게와 자궁의 두 뿔을를 외면 화하다. prewarmed, lactated 울리는의 솔루션 externalized 자궁 뿔이 관개.
2. Transuterine Microinjection
- 12-16 μ : 다음과 같은 특징을 가진 두꺼운 벽으로 둘러싸인, borosilicate 유리 모세관의 microinjection 피펫을 조작m 외경과 20 정도 베벨. ; 압력 = 200; 속도 = 46; = 0를 당길 시간 = 100) 열 = 램프 테스트 플러스 3 단위 : 작은 상자 필라멘트와 셔터 P-97 피펫 풀러에서 다음 프로그램을 사용합니다. 셔터 BV-10 beveler로 대구경 pipettes 위해 104C (금색) 연마 디스크를 사용합니다. 칼슘을 무료로 인산염의 3-4 μg / μL에서 플라스미드 Resuspend 표현이 (산도 7.2-7.4) 염분 버퍼. 30 초 동안 부드럽게 농축 DNA, 와동에 결정 신속한 녹색을 추가하고 10 초간 10,000g에 스핀. 시각 주사의 효능을 추적하는 데 필요한 빠른 그린의 최소 금액은 경험적으로 결정됩니다. DNA / 빠른 그린 솔루션 beveled 피펫을 Backfill. 압력 주입기 (Picospritzer 소스 가스 등> 99% 순수한 질소를 사용하여)의 피펫 홀더에 로드된 microinjection 피펫에 연결합니다.
- 낮은 강도, 그 주입 사이트 내에서 배아를 시각화하는 할로겐 라이트와 함께 자궁을 Transilluminate. 비 확인힘들 심장, 뇌 vesicles, 사지 꽃봉오리, hindbrain의 초기 4 번째 뇌실, 그리고 눈. prewarmed로 매 2 분, 수화를 유지하기 위해 울리는의 솔루션을 lactated 자궁을 관개하다. 배아의 방향과 해부 학적 경계표 위에서 언급 식별 자궁에 부드러운 압력을 적용합니다.
- 동양은 배아 앞부분과 후부 가지의 측면 otocyst가있는 mesenchymal 지역 주요 헤드 정맥을 식별합니다. 적절한 otocyst은 자궁 transillumination로 볼 수 없습니다. otocyst은 정맥의 메인 트렁크와 함께 미국의 풋볼 경기에서 uprights 또는 goalposts의 모양을 형성, 주요 헤드 정맥의 앞부분과 후부 지점 사이의 중간에 위치하고 있습니다. otocyst는 uprights 사이의 중간입니다.
- otocyst의 추정 위치와 라인의 궤도에있는 자궁을 통해 주입 피펫을 삽입합니다. uter 통과 후 한번 microinjector를 펄스우리는 추적 염료 및 피펫 팁의 대략적인 위치를 시각화합니다. 마이크로 미터 제어에서 피펫을 향상하고 깊이를 평가하기 위해 다시 펄스. 또한 반복 측면 헤드 mesenchyme 및 펄스로 피펫을 향상. 성공 otocyst 타겟팅 dorsally endolymphatic 덕트와 가리비 현관의 껍질 모양의 테이퍼 모양을 보여줄 것입니다. 자궁에 압력을 풀어 한 동작으로 배아 / 자궁에서 피펫을 제거하고 즉시 prewarmed와 자궁을 관개, 울리는의 솔루션 lactated.
3. 생체내의 Electroporation에
- lactated 울리는의 솔루션과 함께 자궁을 관개하다. 갓 적용 lactated 울리는의 솔루션은 전기 부부 패들 스타일 전극에 자궁에 필요합니다. lactated 울리는의와 전극의 텅스텐 표면을 축축하게하다. 전극의 경로 센터 주입 otocyst합니다. 부드럽게 electroporation 파와 자궁을 압축ddles. 음극은 주입 otocyst과 양극이 uninjected otocyst에 인접한 자궁 벽과 접촉에 대한 측면 질 벽에와 접촉이다. electroporator에 발 페달 스위치와 함께 사각형 웨이브 펄스 열차를 실행. Electroporation 매개 변수는 다음과 같습니다 펄스 당 43 볼트와 950 밀리초 interpulse 지연에서 5, 50 밀리초 펄스. 펄스 트레인이 게재된 직후 자궁을 관개하다. 60-100 mAmps 귀의 상피 progenitors을 transfect 충분히 : 조직에 전달 전류가 기록합니다. 주사와 댐 당 4-6 E11.5의 배아를 electroporate.
- 그의 내면의 귀있는 그 배아들 중 4 번째 뇌실로 수성 형광 dextran (알렉사 형석 488 플라스미드 표현식이 녹색 형광 단백질을 암호화하는 경우 플라스미드 표현식이 빨간색 형광 단백질이나 알렉스 형석 594을 암호화하는 경우)의 두 번째 독립 transuterine microinjection을 수행 정확하게 주입 및 펄스 당 전류의 최소 60 mAmps이 드했습니다electroporation시 livered. 형광 dextran은 hindbrain에서 출생에서 감지하게 내면의 귀 (3.5 참조) embryogenesis 동안 조작되었다 새끼의 선택을 가능하게합니다.
- lactated 울리는의와 자궁 뿔이 관개. 복강으로 자궁 뿔을 꽂아. prewarmed, lactated 울리는의 솔루션 중 2-4 ML과 자궁 캐비티를 플러시하고 오버플로가 무균 드레이프로 절개 사이트 밖으로 배수 수 있습니다. 건조, 살균 소재 draping를 교체합니다. 비 절삭 바늘과 6-0 resorbable 봉합사와 복부 벽 봉합해. 우리는 복벽과 피부 모두에 대해, 다른 모든 바늘을 잠금, 실행 바늘을 선호합니다.
- 댐 '털'을 건조하고 피하 주사에 의해 비 steroidal 안티 - 염증성 같은 Meloxicam으로 관리할 수 있습니다. 멸균 드레이프에 prewarmed 복구 케이지에 댐을 반환합니다. 모니터와 피묻은 방전을위한 댐 '호흡, 절개 사이트 명백하고, 질을 기록합니다. 출혈은 라스입니다다시 있으나, 현재와 줄지 않는 경우에 그녀가 마취하에있는 동안, 댐을 안락사. 그녀는 의식과 ambulate하려는 시도을 차릴 시간을 확인합니다. 그녀가 먹고 마시의 흔적을 보여줍니다과 둥지가 만들기 시작되면 마우스 식민지로 댐을 반환합니다. 일반적으로 이것은 12 시간 내에 발생합니다.
- 출생시 (출생 후의 일 0), 플래시 GFP 또는 텍사스 레드 필터로 stereofluorescence 해부 현미경을 사용하여 형광 dextran을 감지할 쓰레기의 각 강아지의 hindbrain 지역은 적절하게 설정합니다. 오직 lactating 댐 hindbrain 라벨을 표시 그 새끼로 돌아가기.
4. 대표 결과
1 그림. 개발 달팽이관에 Electroporation - 매개 유전자 전달. E11.5 otocyst은 (펄스 tra 표현 플라스미드 인코딩 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)와 electroporated 맞았 었소매개 변수 : 다섯, 50 밀리초 / 펄스와 950 밀리초 interpulse 지연)에서 43 볼트 104. otocyst 달팽이관의 중간 회전을 통해 기지에서 EGFP 표정을 보여주 E11.5에 주입하고 electroporated되었다 강아지 출생 후의 일 6 (P6)에서) 담당자 내이 (内耳). 달팽이관의 측면 벽은 중간 턴하 꼭대기에서만 제거되었습니다. 꼭대기에 야기할 E11.5의 progenitors은 transfected되지 않았습니다. B)에 달팽이관의 immunostaining 전체 마운트는 () 헤어 셀 표식으로 마이 오신의 7A (Myo7a)는 해당 EGFP 표현은 Corti의 기관의 궤도를 따라하고 조잡한 머리카락 세포 베어링 감각 상피에 현지 나타냅니다. otocyst E11.5에 주입하고 electroporated되었다 E18.5 배아로부터 C) 대표 내이 (内耳). 레이저 공촛점 투영은 Myo7a - 긍정적인 감각 세포에서 EGFP 표현을 보여줍니다. EGFP expressio을 나타내는 Corti의 E18.5 기관에서 달팽이 감각 상피의 D) 레이저 공촛점 투영N 내부 세포의 (ihc), 바깥쪽 세포 (ohc), 내부 phalangial 세포 (IPC), 기둥 세포 (PC) 및 Deiters '세포 (DC). (B)의 규모가 막대는 ()에 적용됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
개발 마우스 내이 (内耳)에 유전자 이체 : 마우스 내이 (内耳)는 postimplantation 개발 12,13의 첫 주 동안 귀의 placode에서 개발하고 있습니다. 배아 일 9.5 (E9.5)으로 placode는 invaginated했으며 otocyst 2라는 액체가 채워진 소포로 morphed. 소포에 귀의 엽 성의 전구 물질이 성숙한 내이 내의 감각과 nonsensory 세포뿐만 아니라 vestibular과 청각 감각 상피 조직에 기계적으로 민감한 세포를 신경을 분포시키다 뉴런을 야기할. 늦은 배아 단계함으로써, 내이 (内耳)의 막의 미로의 복잡한 3 차원 형태는 3,12를 설립하고 있습니다. 이득과 손실 함수는 실험적 modalities는 일반적으로 이러한 세포의 운명 사양과 패턴 형성 등의 발달 과정의 유전자 조절에 대한 통찰력을 얻기 위해 마우스 transgenesis에 의해 수행됩니다. 개발 마우스 내이 (内耳)의 다이내믹 유전자 조작의utero 마우스 transgenesis에 대한 무료 접근을 나타내는 생쥐를 실험 발생학 6,11있는 커플 유전자 전달 기술을.
바이러스와 electroporation-매개 유전자 전달 기술 개발 내이 6,11,14,15에서 유전자 발현을 조작하기 위해 개발되었습니다. Adeno - 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 감각과 nonsensory 세포 유형 야기할 및 마우스 세포 16 칼슘 의존 exocytosis의 분자 기초를 심문하는데 사용되었습니다 귀의 progenitors을 감염. AAV 벡터는 내이 (内耳)에 폭넓은 표현을 가능하게하고 다른 바이러스성 serotypes가 차등 세포 표현 유리한 수도 독특한 tropism을 표시할 높은 titers을 생산하고 있습니다. 단점은 misexpressed 수있는 유전자 및 virological 전문성하게 정화하고, 바이러스 titer하기위한 요구 사항의 크기를 제한하는 고정 충전재 용량이 포함됩니다. Electroporation - 매개 유전자 TRansfer는 생체내 6에서 감각 헤어 셀 운명을 지정에서 기본적인 나선 루프 - 나선의 전사 인자의 역할을 평가하는 데 사용되었습니다. 게이트웨이 subcloning 기술에 맞게 표현 plasmids 고유 추구하는 유전자의 - 관심과 IRES 서열 17 일부터 형광 마커 단백질의 표현을 유도와 벡터의 신속하고 효율적인 건설을 허용합니다. 관심있는 유전자를 사용 발기인에 따라 출생 후의 내이 (内耳)에 유지 수 electroporation와 표현의 24 시간 이내에 귀의 엽 성의 전구 물질로 표현 할 수 있습니다. 플라스미드 건설, 정화, 집중력, 그리고 quantitation은 표준 분자 생물 학적 기술을 필요로합니다. 단점은 ~ 8킬로바이트 상기 플라스미드의 크기 증가 및 대부분의 바이러스성 벡터에 비해 배아 주죠의 높은 비율로서 생체내 transfection 효율 감소 등이 있습니다. 모두 electroporation 및 바이러스 매개 유전자 전달 기술은 마우스 실험 embryological 기술의 숙달을 필요로niques : 생존 수술, utero의 배아의 조작과 transuterine microinjection 인치 본 원고의 목표는 디지털 비디오 현미경에 의한 각각의 중요한 방법론적인 단계를 시연하여 후자의 문제를 해결하는 것입니다.
동영상에 대한 방법 론적 사항 : 뷰어 댐, 즉 머리를 (의도적으로 대부분의 모호 총 해부학에 관련된 복부 중간선의 위치를 볼 수 있도록 촬영하는 동안 우리는 의도적으로 살균 필드로 절개 사이트를 내리면 t하지 않기로 프레임하지만 인식할 수), 사지 및 꼬리. 절개 사이트를 Draping하면 사실상이보기를 차단하고 복부 개복술 및 사출 시퀀스 동안 spatially 관련된 해부 학적 관계를 감사하기위한 노력을 먹이고 있습니다. 그러나 멸균 분야에 externalized 자궁 빵 나머지는 외과 무균을 유지하도록 댐의 복부를 draping 좋습니다. 또한, 우리는 고의적으로 귀신을 시도하지 않았다이러한 방법은 수의사 또는 공인 외과 기술자의 전문적인지도에 의해 배울해야하기 때문에 복벽과 피부 외과 incisions의 suturing을 trate. 박사 마르셀 I. Perret-Gentil은 (샌 안토니오 텍사스 대학교), "수의학 Suturing의 원리."그의 유인물에 회화 표현으로 완벽하게이 주제에 탁월한 논의를 제시 18
절차적 추천 : 개발 마우스 내이 (内耳)에 유전자 이체는 기술적으로 도전하고 있습니다. 다양성의 상당한 금액을 제거하고 성공적인 결과를 보장합니다 모범 사례 일련의가 있습니다. 우리는이 실험적인 접근 방법을 학습 촉진하기 위해 아래의 구체적인 권장 사항을 확인하십시오.
마우스 생존 수술 동물 치료 프로토콜을 개발하기 위해 수의학 직원에게 문의하십시오 : 포유류의 생존 수술에 대한 동물 보호 프로토콜은 생산 요구되고 이후마취, 진통제, 그리고 perioperative주의가 정의되고 조정되어야한다. 본인의 프로토콜의 핵심을 이루고 있습니다 언어를 포함하여 동물 보호 프로토콜 개발의 세부적인 논의가 보충 정보 ( "표시대로 제시됩니다 동물 관리 프로토콜 개발 "). 또한, 홈 기관 '동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 및 수의학 직원들은 의심할 여지없이 요청에 따라 적합한 프로토콜의 수립에 추가 지침을 제공합니다.
utero 유전자 전달에 대해 전용 마우스 생존 수술 영역을 마련한다 : 그것이 뱃속을 떨어뜨리고 있기 때문에 복부 개복술이 큰 수술로 분류됩니다. 대부분의 IACUCs 주요 마우스 생존 수술 멸균, 학급 100 환경을 요구하지 않습니다. 오히려 그 전용 면적이 적절한 조명, venti를 포함lation, 보조 난방 및 하드는 비 다공성, disinfectable 표면은 가능성이 필요합니다. 우리는 감염으로부터 마우스를 보호 생리적 스트레스를 줄여 수평 층류 후드에서 우리의 생존 수술을 실시하고,이를 통해 시설 수술후 회복하는 것을 선호합니다. 벤치 최고의 단편와 함께 recessed 전원 콘센트, 전원 유전자 전달 장비에 확장된 전기 회로, 우리는 방향, 낮은 와트 할로겐 트랙 조명 등이 진동 - 감쇠, 수평 층류 후드 (Envirco LF 630)로 정의 변경의 시리즈를 정의한 코드 통로입니다. 이러한 수정의 상세한 설계도가 보충 정보 ( "참조대로 제시됩니다 Utero의 유전자 전송에서는 층류 후드를 "). 당신이 마우스 통화에 독점적으로 전념하고 있습니다 적당한 위치를 정의하기 위해 동물 치료 프로토콜을 개발로 IACUC에게 문의수술 rvival.
나트륨 pentobarbital 마취를 투여하기 전에 가장 가까운 0.1 그램에 댐을 무게 : pentobarbital 나트륨은 효과적인 마취제이며 권장 먹이지 일정 미행 때 작업 시간을 최소한 105분를 제공합니다. 주입 마취 혼합물의 복용량을 계산하기 전에 각 댐에 대한 정확한 체중을 결정합니다. 댐 체중을 추정하지 마십시오. Becton Dikison에서 알레르기 주사기 트레이 바늘과 주사기를 사용하여 인간의 intradermal 베벨 임신 쥐에 atraumatic intraperitoneal 주사에 이상적입니다. 또한,이 주사기는 매우 낮은 죽은 공간 용적을 가지고 있으며, 일반적으로 누구의 배아 E11.5 또는 E12.5에있는 댐에 필요한 마취 볼륨의 범위에 대한 보정합니다.
태아의 생존을 지원하기 위해 예방 진통제를 배포합니다 : 등, 봉합 라인에서 국소 마취를 관리Bupivicaine, 사전에 그 진통제는 시간에 보드에 있도록 복구 새장에 댐을 배치하는 등 Meloxicam 등 체계적, 비 steroidal 항염증성 약물은 댐이 마취에서 복구합니다. 댐에 불편을 줄이면 건강한 임신의 수술후의 회복과 유지 보수를 용이하게합니다.
베벨 microinjection의 pipettes와 긴밀 외경 제한 : 배아 주죠 중 하나의 가장 흔한 원인은 바로 조직 및 / 또는 저조한 건설 microinjection의 pipettes에서 혈관 손상입니다. E11.5 마우스 otocyst로 Transuterine microinjection은 나이 배아에서 큰 장기 (즉, 뇌 vesicles, 눈, 사지 등)에 주사와는 다른 제약을 운반합니다. Unbeveled, 저조한 beveled, 또는 부적절하게 큰 외경의 pipettes은 배아 생존이 줄어 듭니다 자궁의 혈관, 내장 난황 vasculature 및 / 또는 E11.5에서 배아에서 출혈이 발생합니다. 그것은 가능하다위해 적절한 베벨 가지고 작은 직경의 내구성 pipettes를 손으로 깰 수 있지만 그렇게 일상적으로 할 어렵습니다. 그의 작은 otocyst 대상 E11.5 마우스 배아는 용서할 줄을 될 것입니다. 피펫 설계 및 제조 19 전체 담론을위한 셔터 인스 트루먼 트에서 P-1000 P-97 피펫 요리책 2011를 참조하십시오. 이 작품에 사용된 pipettes에 대한 매개 변수가 위에 명시된하고 그들의 제조가 완전히 이전 11 논의되었습니다. 셔터 인 스트 루먼트 BV-10 beveler에 대한 제조 업체의 설명서에있는 절차 메모도 훌륭한 자원입니다.
transuterine microinjection하여 otocyst을 mistargeting하면 발생하는 이유를 이해 : 비디오 E11.5 및 E12.5 otocyst로 transuterine microinjection을위한 이상적인 결과를 보여줍니다. otocyst을 Mistargeting 것은 대개 너무 깊게, 너무 피상적 주입이나 inadequately 가공 pipettes의 결과. 그림 2는 이러한 조건을 보여줍니다. 패널이 otocyst로 빠른 그린 솔루션의 성공적인 transuterine microinjection 후 transillumination하여 몇 군데 E12.5 배아의 왼쪽 측면 전망을 보여줍니다. hindbrain (HB)는 otocyst에 쐐기 모양의 노치 지느러미로 나타납니다. 눈 (E)는 주변과 왼쪽 forelimb가 두드러진이다 따라 안료의 환대가 있습니다. 기본 머리 정맥 (phv)의 주요 줄기는 otocyst 아래입니다. otocyst는 검은색 나타나는 빠른 그린으로 가득합니다 : 지느러미는 endolymphatic 덕트 (ED)과 otocyst (OC)의 전정은 분별이 될 수 있습니다. E11.5-12.5 otocyst 성공적으로 타겟팅은 항상 명확하게보고 알 수있는 endolymphatic 덕트 및 현관를 제공합니다. 패널은 '가 주입 otocyst의 비판적 검토를 촉진하는 흰색 라벨이없는에서와 같은 이미지를 보여줍니다.
그림 2. transuterine microinjec하여 otocyst를 mistargeting에 그림 가이드기. 모든 패널 hindbrain-midbrain 지역의 지느러미 전망이다 패널 H, 제외 midbrain 위 forebrain 왼쪽으로 E12.5 배아의 왼쪽 측면 전망을 보여줍니다. 각 행에있는 패널은 동일한 배아의 이미지를 나타냅니다. otocyst mistargeting의 원인에 대한 자세한 설명을 논의를 참조하십시오. 약어 : E, 왼쪽 눈, 에드, endolymphatic 덕트, FG, 빠른 그린, HB, hindbrain, 파운드, 사지 새싹, OC, otocyst;에게도, 귀의 영토, P, 피펫, phv, 기본 머리 정맥, PT, 피펫 팁.
피상적인 주입 mistargeting의 일반적인 원인입니다. 패널은 E12.5 conceptus에 피상적인 주입을 설명합니다. hindbrain (HB) 노치와 귀의 지역 (OT, 동그라미)이 왼쪽, 가로보기에 분명 있습니다. microinjection의 피펫 (P)는 전경에 있습니다. 빠른 그린 (FG)은 피펫 팁 (B)에서 꺼내하기 시작하고, 압력 주입기 (CD), 염료 diffuses의 후속 펄스 가진 타원형 모양으로. 회의 분포전자 염료 그것이 질 벽에과 내장 난황, exocoelomic 충치 봉투 extraembryonic 멤브레인 사이에 도입된 것이 좋습니다. 실험자이 배아에서 otocyst을 다시 타겟팅을 시도하지 말아야하지만, 다음 배아로 이동합니다. 여러 주사 감소 배아 생존, E12.5보다 E11.5에서 더 심각 효과와 연관.
딥 주입 mistargeting보다 일반적인 원인입니다. 패널 FH는 hindbrain에 귀의 영토 통과 사출 궤도를 보여줍니다. 기본 머리 정맥 (phv)는 왼쪽 눈 (전자) 및 피펫 (P)는 E12.5 배아의 가로보기에 분명 있습니다. 빠른 그린 (FG)의 초기 방출은 기본 헤드 정맥 / 귀의 지역에 대하여 dorsally 있질 않습니다. 이후의 펄스로 쐐기 모양의 hindbrain (HB)는 완전히 빠른 그린 (패널 G)으로 채워졌다. 주입된 배아의 90도 회전 hindbra 내에 빠른 그린의 검출을 허용지느러미보기 (패널 H)에서 공동 인치 그것이 자궁과 연락을 취하 후 microinjection 피펫의 깊이를 인식하는 무능력으로부터 모두 외면하고 깊은 주사 결과. 잘 작동 실용적인 접근 방식은 자궁을 통해 피펫을 향상하고 즉시 빠르게 녹색의 퍼프를 찾을 번 파동하는 것입니다 : 퍼프의 위치는 피펫 팁의 대략적인 위치를 나타냅니다. 이 범위 조사 펄스를 기반으로 깊이를 조정합니다.
Inadequately 가공 pipettes은 mistargeting의 가장 흔한 원인입니다. 패널에 표시된 주입 시도가 IK를 수동으로 고장지만, beveled되지 피펫 팁으로 실시되었다. E12.5 배아의 가로보기 hindbrain (HB), 왼쪽 눈 (마), 그리고 microinjection의 피펫 (P)을 보여줍니다. 피펫 팁 (PT)이 급격히 숙이고이며 (패널 I) 자궁에 침투하는 데 실패했다고합니다. 추가적인 무력 신청 씨를두고, 피펫 (패널 J, 화살표)의 끝부분을 가위두기 끝이 자궁에 포함. 빠른 그린 (FG)의 작은 금액은 골절 피펫으로부터 배출되어 자궁의 표면을 발견했다. 임베디드 피펫 팁 (패널 K는) 괜찮아, 멸균 집게로 제거하고 sharps 폐기물로 폐기되어야합니다. 피펫 팁가 위치해 있거나 성공적으로 제거할 수없는 경우에는 마취하에 댐을 안락사.
마우스 생존 수술 데이터 시트에 대한 절차적 관찰 문서 : 이러한 방법을 학습에 중요한 요소는 관측을 문서화하고 이러한 관찰을 바탕으로 조정하는 것입니다. 마우스 생존 수술 데이터 시트를 생산하고, 수술 전 수술, 그리고 수술 후 정보를 기록해 둡니다. 수술 전 데이터 댐 체중, 마취 전달의 복용, 플라스미드 주입 등 수술 데이터 (즉, R2가 바로 자궁 뿔의 난소에서 두 번째 배아입니다) 배아 주입을 포함, 주사의 품질 (예, 아니 endolymphatic 포함 덕트는 4 년, 염료를 감지
transfection 효율을 최적화하기 위해 펄스 당 배달 현재 사용 : 950msec 인터있는 정사각형 웨이브 펄스 트레인은 5로 구성되어 43volt, 50msec 펄스펄스 지연. 5mm 플래티넘, 패들 스타일의 전극은 전체 귀의 지역이 전기장 내에 포함되어 있는지 확인합니다. 그들은 정확하게 위치가 더 어렵습니다하지만 비슷한 transfection 효율은 3mm 충격기 구현할 수 있습니다. 펄스 패러다임이 아닌 전압을 통해 청소 및 transfection 효율을 평가하여 최종 펄스 동안 배아로 전송 전류를 평가하여 최적화되었다. 근거는 펄스 당 배달 현재는 자궁과 백금 전극 사이에 전기 커플링의 명백에 따라 일정한 전압에 차이가있다는 것입니다. 자궁은 갓 즉시 사전에 항공사는 초과 존재 충격기와 요금을 배치하는 것이 lactated 울리는의 솔루션으로 irrigated되는 가정, 치프 변수는 '노'와 함께 자궁에 적용 "커플링"압력의 금액입니다. 최상의 전류 전송과 산발적 transfection의 <장치 60mAmps의 43volts 결과에서 젠틀 압력. 43v에서 보통 압력60 100mAmps의 olts 결과를 전달하고 가장 효율적인 transfection. 의 43volts 결과에 무거운 압력> 100mAmps가 전달하고 지속적으로 변경 심장 박동과 상호 및 배아 주죠 증가했습니다. 과도한 압력 내장 난황합니다 ( "대중"은 '노'를 통해 느낄 수 있습니다) 파열 및 배아 주죠 발생합니다. 그것은 적용된 변수 압력이 전달 전류에 영향을 전극 사이의 임피던스를 바꿀지도 모르겠어 가능성이 높습니다. 1Hz (초에 한 50 밀리초 펄스)의 펄스 주파수는 배아 생존을 위해 상관 관계를 긍정적 배아의 심박주기에 이상 파괴로 정의되었다. 우리는 생체내 electroporation의 패러다임에 효율적으로 수립에 모니터링하는 가장 중요한 매개 변수는 펄스에 따라 제공되는 최신인지 결론. 모든 펄스 패러다임의 변경은 펄스 당 배달 전류의주의 모니터링을 포함해야합니다.
일 학습에 모듈러 방식을 채택전자 기술 : 모듈 1 : 자궁 externalization과 가짜 수술을 연습하지만, 주사 또는 electroporate하지 않습니다. 댐은 매우 잘 복부 개복술을 용납하고 수술 기법에 관한 postsurgical 합병증을 경험하지 않습니다. 마우스 생존 외과 능력은 의심의 여지없이 때문에 적절한 교육을 추구 홈 기관에 거주하고 있습니다. 진행하기 전에 외과 기술의 숙달을 달성. 모듈 2 :, 마취하에 댐을 안락사 주입 배아를 분리하고, otocyst 주사의 품질을 평가 : 생존 수술을 완료의 기대없이 anesthetized 댐에 otocyst으로 실습 transuterine microinjection. 모듈 3 : 빠른 그린과 2 개의 다른 배아의 목표가 단지 2 otocysts은 electroporate 없어 수술을 완료하고, 하류 배아 생존을 확인합니다. 모듈 4 : DNA / 빠른 그린 솔루션, electroporate 하류 배아 생존의 유효성을 검사하고, 규명 transfection EF와 목표가 단지 2 배아ficiency. 모듈 5 : DNA / 빠른 그린 솔루션을 통해 대상 단지 2 배아는 배아 조작 레이블을 지정하는 4 번째 뇌실로 알렉사 형석 투입, electroporate, P0에서 레이블 배아를 선택하고 규명 transfection 효율.
절차적 학습 곡선 : 마우스 생존 수술 기술의 숙달, 하나의 홈 기관의 수의학과 외과 직원의 적절한지도와 함께, 매우 빠른이며에만 3-5 댐 가치 전문 지식을 얻을 수있는 초보자를위한 연습이 필요합니다. 유용 transfected 내면의 귀를 생성하는 Transuterine microinjection 및 생체내 electroporation에 6 실행 가능한 임신 당 배아 및 모듈형 접근 방식이 이어지는가있는 가정, 노력의 10-50 댐의 가치가 필요합니다. 미세 모터 기술을 필요로 활동을 즐기는 학생 (즉, 악기 연주는 바느질, 모델 제작, 또는 경쟁 운동)은 tho보다 짧은 훈련 기간을 가지고그러지 SE. 이러한 방법의 성공적인 숙달을위한 중요한 상호 자세히 (즉, microinjection 피펫 제조, 혈관 해부학, 명시 노트 - 거저)와 합리적인 차분한 태도로 양심적인 관심입니다.
워크플로우 : 일단 전문성을 얻게되며, 하나가 4-6 댐 당 배아 주입 및 electroporating 예상할 수 있으며, 3-5 배아가 살아 남을 것이다; 및 2-4 배아를 유용하게 분석을위한 내면의 귀를 transfected됩니다. 출생시 분류를위한 라벨 배아에 hindbrain 알렉사 형석 라벨링 기법은 각 electroporated 배아에 추가 hindbrain 주입을 필요로하지만, 이것은 잘 용납되고 부정적인 절차적 효율성에 영향을주지 않습니다. 따라서 생체내의 electroporation의에서 유용하게 transfected 안쪽 귀의 복구 속도가 heterogygous 번식 패러다임의 homozygous 돌연변이 생쥐의 회복 속도에 호의를 비교합니다. 경험을 바탕으로 하루에 실험자 당 2-3 댐은 합리적인 작품입니다유량 : 1.5 수술 댐 당 시간 및 수술 모니터링 1.5-2 시간의 총.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 원래 참조 11 페이지 130에 출연 microinjection의 피펫 제조 수치를 게시할 수있는 권한에 대한 Humana 보도 감사, videography에 대한 래리 Dlugas와 스티븐 왕, 교육 통신 OHSU학과, 영상 디자인 및 편집 래리 Dlugas; 아담 M. O '퀸, 수석 디자이너, 기술적인 설계도를 제공하기 위해 우리의 정의 수평 층류 후드와 레 금세 공인을 디자인 Trion / Envirco, 빅터 Monterroso, 뮤직 비디오, 석사, 박사와 톰 Chatkupt, DVM, 비교 의학 OHSU학과,지도에 대한 우리 함께 동물 보호 프로토콜, 수술 기법 및 예방 진통제 처방, 마르셀 Perret-Gentil, DVM, MS, 수의학 suturing 기법에 그의 유인물을 공유하기위한, 우리의 어도비 프리미어 프로 영상 현미경 컴퓨터 워크 스테이션을 설계 에드워드 Porsov, 석사, 그리고 레아 공주와 LNS의 요나 Hinckley은 (포틀랜드 오레곤) 자막. 이 작품은 난청과 othe에있는 국립 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다R 통신 장애 : DC R01 008595 및 DC R01 008595-04S2 (JB까지)와 P30 DC005983 (오레곤 청각 연구 센터 코어 그랜트, 피터 길레스피, 교장 탐정).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
