Summary
A orelha interna do rato é um órgão sensorial placode derivado cujo programa é elaborado de desenvolvimento durante a gestação. Nós definimos uma
Abstract
A orelha de mamífero interior tem 6 epitélios distinta sensorial: 3 cristas na ampolas dos canais semicirculares; máculas no utrículo e sáculo e do órgão de Corti na cóclea enrolada. O cristas e máculas conter células ciliadas vestibulares que transdução estímulos mecânicos para servir à especial sentido de equilíbrio, enquanto que as células ciliadas auditivas no órgão de Corti são os transdutores primários para ouvir 1. Especificação célula destino nestas epitélio sensorial e morfogênese dos canais semicirculares e cóclea ter lugar durante a segunda semana de gestação em camundongos e são praticamente concluída antes do nascimento 2,3. Estudos sobre o desenvolvimento da orelha interna do rato são rotineiramente realizados pela colheita de embriões transgênicos em diferentes estádios de desenvolvimento embrionário ou pós-natal para obter insights sobre a base molecular do celular e / ou morfológica fenótipos 4,5. Nós supomos que a transferência de genes para a orelha interna do rato em desenvolvimento no útero </ Em> no contexto de ganho e perda de função de estudos representa uma abordagem complementar ao transgênese mouse tradicional para o interrogatório dos mecanismos genéticos subjacentes ao desenvolvimento do ouvido interno de mamíferos 6.
O paradigma experimental para realizar estudos de expressão ectópica de genes na orelha do mouse desenvolvimento interior demonstrado aqui resolve-se em três etapas gerais: 1) laparotomia ventral; 2) microinjeção transuterina e 3) em eletroporação in vivo. Laparotomia ventral é uma técnica de sobrevivência do mouse cirúrgica que permite a exteriorização do útero para ter acesso experimental para os embriões implantados 7. Microinjecção transuterina é o uso de chanfradas micropipetas, capilares de vidro para introduzir plasmídeo de expressão para dentro do lúmen da vesícula ótica ou otocyst. In vivo electroporação é a aplicação de onda quadrada, directos impulsos de corrente para dirigir a expressão de plasmídeo em 8-10 células progenitoras.
11. Rato experimentais técnicas embriológicas pode ser difícil de aprender com prosa e imagens por si só. No presente trabalho, demonstramos os 3 passos no processo de transferência de genes. Mais criticamente, com a implantação de microscopia de vídeo digital para mostrar precisamente como: 1) identificar a orientação do embrião no útero; 2) reorientar embriões para alvejar as injeções para o otocyst; 3) microinject DNA misturado com calda de corante no otocyst nos dias embrionárias 11,5 e 12,5; 4) electroporate o otocyst injetada e 5) embriões rótulo eletroporados para a seleção pós-natal ao nascimento. Nós fornecemos exemplos representativos de sucesso transfectadas ouvidos internos, um guia ilustrado para as causas mais comuns de mistargeting otocyst; discutir como evitar erros comuns metodológicas e diretrizes presentes para escrever um in utero geno protocolo de transferência de cuidados com animais.
Protocol
1. A laparotomia ventral
- Anestesiar uma barragem cuja embriões são no dia embrionário 11,5 (E11.5; meio-dia no dia um rolhão vaginal é detectado é dia de desenvolvimento embrionário 0,5), por injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio da solução anestésica (7,5 uL por peso de corpo grama). Trabalhando solução anestésica: 180 uL de 50 mg / mL solução de sódio pentobarbital; 100 uL de etanol absoluto; 320 uL de 65 mg / mL de sulfato de magnésio aquoso (modula tom uterina); e 400 uL de propileno glicol (miscível veículo com uma solução aquosa e orgânica componentes).
- Avaliar a completude da anestesia através da realização de testes de estímulos nocivos: squeeze pata; pitada cauda; e piscar de resposta ao toque bochecha e vibrissas. Aplicar pomada oftálmica estéril para as córneas.
- Raspar o pêlo da área abdominal suprapúbica para a caixa torácica com uma tesoura e uma lâmina fina (Oster lâmina # 40). Desinfectar o abdómen com etanol a 70%, iodo povidona 10% (Betadine), umnd etanol 70%, seqüencialmente. Lugar do mouse abdômen virado para baixo em um pano estéril e em seguida, definir sobre uma almofada de aquecimento ou chapa quente (37 ° C) por 2-5 minutos.
- Faça uma incisão na pele abdominal na linha média ventral com bola com ponta de tesoura. Alargue a incisão para 10-14 mm. Identificar a linha alba, um avascular, faixa de tecido conjuntivo branco ao longo da linha média ventral da parede abdominal. Faça uma incisão na linha alba com a bola derrubou uma tesoura e estender a incisão 10-14 mm. Imediatamente irrigar o abdômen com pré-aquecido (37 ° C) solução de Ringer com lactato.
- Exteriorizar as duas pontas do útero com uma pinça de anel, sem aplicar pressão excessiva sobre os locais de implantação. Irrigar os cornos uterinos externalizados com pré-aquecido, solução de Ringer com lactato.
2. Microinjeção transuterina
- Fabricar uma espessura de parede, vidro borosilicato pipeta de microinjeção capilar com as seguintes características: 12-16 μm de diâmetro exterior e um bisel de 20 graus. Em um extrator da pipeta Sutter P-97 com filamento pequena caixa, use o seguinte programa: calor = teste de rampa mais 3 unidades; pressão = 200; puxar = 0; velocidade = 46; tempo = 100). Com o beveler Sutter BV-10, utilizar o disco (ouro) 104C abrasivo para pipetas de grande diâmetro. Ressuspender o plasmídeo de expressão em ug 3-4 / uL em fosfato de cálcio livre tamponado salino (pH 7,2-7,4). Adicionar verde rápido cristalina ao concentrado DNA vórtice, suavemente durante 30 segundos, e girar a 10.000 g por 10 segundos. A quantidade mínima de verde rápido necessário para controlar visualmente a eficácia da injecção é determinada empiricamente. Aterrar a pipeta biselada com o DNA / solução de verde rápido. Ligue o pipeta microinjecção carregado para o titular da pipeta da pressão do injector (Picospritzer usando> azoto 99% puro como fonte de gás).
- Transilluminate do útero com baixa intensidade, a luz de halogéneo para visualizar o embrião no seu local de implantação. Identificar o beating coração, vesículas cerebrais, brotos, ventrículo ª nascente 4 do rombencéfalo e oculares. Irrigar o útero a cada 2 minutos, com pré-aquecido e solução de lactato de Ringer para manter a hidratação. Aplique uma leve pressão sobre o útero para reorientar o embrião e identificar os pontos anatômicos mencionados acima.
- Oriente o embrião para identificar a veia principal, cuja cabeça anterior e posterior do flanco ramos do território mesenquimal em que o otocyst reside. O otocyst adequada não pode ser visto por transiluminação do útero. O otocyst está localizado a meio caminho entre os ramos anterior e posterior da veia cabeça primário que, juntamente com o tronco principal da veia, formar a forma dos pilares ou postes de um campo de futebol americano. O otocyst está a meio caminho entre os postes.
- Inserir a pipeta de injecção através do útero de uma trajectória em linha com a localização presuntiva do otocyst. Pulsar o microinjector uma vez, depois de passar através do uternos visualizar o corante marcador, a localização aproximada da ponta da pipeta. Avançar a pipeta sob controle micrômetro e pulse novamente para avaliar a profundidade. Avançar a pipeta no mesênquima lateral da cabeça e pulso repetidamente. Segmentação otocyst sucesso irá revelar a forma afilada do ducto endolinfático dorsalmente ea forma de concha de vieira do vestíbulo. Solte a pressão sobre o útero, remover a pipeta do embrião / útero em um movimento, e imediatamente irrigar o útero com pré-aquecido, solução de Ringer lactato.
3. Em electroporação in vivo
- Irrigar o útero com solução de Ringer com lactato. Solução recentemente aplicado de Ringer com lactato é necessária para os eletrodos eletricamente par de remo de estilo para o útero. Umedeça as superfícies dos eletrodos de tungstênio com Ringer com Lactato. Centro da otocyst injetado no caminho dos eletrodos. Gentilmente comprimir o útero com o pa eletroporaçãoddles. O cátodo está em contacto com a parede uterina lateral à otocyst injectado eo ânodo está em contacto com a parede uterina adjacente ao otocyst não injectada. Dispara um trem de pulso de onda quadrada com o interruptor de pedal na electroporator. Eletroporação parâmetros são: 5, 50 ms pulsos em 43 volts por impulso e 950 ms de atraso interpulso. Imediatamente irrigar o útero após o trem de pulsos é entregue. Gravar a corrente fornecida ao tecido: 60-100 mAmps é suficiente para transfectar óticos progenitores epiteliais. Injectar e electroporate 4-6 embriões, E11.5 por barragem.
- Executar um segundo, microinjecção independente transuterina de fluorescente aquosa de dextrano (Alexa Fluor 488 se o plasmídeo de expressão codifica uma proteína vermelho fluorescente ou Alex Fluor 594 se o plasmídeo de expressão codifica uma proteína fluorescente verde) para o ventrículo th 4 desses embriões cujo interior orelhas são injetado com precisão e pelo menos 60 mAmps de corrente por pulso era delivered durante eletroporação. O dextran fluorescente será detectado ao nascer no cérebro posterior e permitir a seleção de filhotes cujo interior ouvidos foram manipulados durante a embriogênese (ver 3.5).
- Irrigar os cornos uterinos com Ringer com Lactato. Reinserir os cornos uterinos para dentro da cavidade abdominal. Lave a cavidade uterina com 2-4 mL de pré-aquecido, solução de Ringer com lactato e permitir que o excesso seja drenada do local da incisão para a cortina estéril. Substitua o draping com material seco e estéril. Suturar a parede abdominal com uma agulha não cortante e uma sutura reabsorvível 6-0. Nós preferimos um ponto corrido, travando cada ponto outro, tanto para a parede abdominal e da pele.
- Seque pele das barragens e administrar um não-esteróides anti-inflamatórias, tais como Meloxicam por injecção subcutânea. Volte a represa para a gaiola de recuperação pré-aquecido em uma cortina estéril. Monitore e registre as respirações das barragens, a patência local da incisão e vagina de secreção sanguinolenta. O sangramento é rare, mas se presente e, sem trégua, a eutanásia da barragem, enquanto ela ainda está sob anestesia. Observe o tempo, ela recobra a consciência e as tentativas de deambular. Retorne a barragem para a colônia do mouse quando ela mostra sinais de comer e beber e começou a construir ninho. Tipicamente, isto ocorre no prazo de 12 horas.
- No momento do nascimento (dia pós-natal 0), flash região rombencéfalo de cada filhote da ninhada para detectar o dextran fluorescente usando um microscópio de dissecação stereofluorescence com GFP ou Red Texas filtro definido como apropriado. Voltar para a barragem de lactação somente os filhotes que mostrar rotulagem rombencéfalo.
4. Os resultados representativos
Figura 1. Electroporação transferência de genes mediada para a cóclea em desenvolvimento. O otocyst E11.5 foi injectado com um plasmídeo de expressão de proteína de codificação verde melhorada fluorescente (EGFP) e electroporado (pulso tranos parâmetros: cinco, 43 pulsos volts a 50 ms / pulso e 950 ms de atraso interpulso). A) orelha Um representante interior a partir de um dia pós-natal 6 (P6) pup cuja otocyst foi injectado e electroporado em E11.5 demonstrando a expressão EGFP a partir da base através da espira média da cóclea. A parede lateral da cóclea foi removido da espira média e ápice só. Progenitores E11.5 que dão origem ao ápice não foram transfectadas. B) de montagem Whole imunocoloração da cóclea em (A) com o marcador de células ciliadas, miosina 7a (MYO7A), indica que a expressão EGFP segue a trajectória do órgão de Corti e é grosseiramente localizada ao cabelo epitélio célula-rolamento sensorial. C) Um representante da orelha interna de um embrião E18.5 cuja otocyst foi injetado e electroporados em E11.5. A projeção a laser confocal demonstra a expressão EGFP em MYO7A-positivos células sensoriais ciliadas. D) A projeção a laser confocal do epitélio coclear sensoriais do órgão de Corti E18.5 indicando EGFP expression nas células ciliadas internas (CCI), as células ciliadas externas (CCE), células internas phalangial (IPC), células pilar (PC), e células Deiters "(cc). A barra de escala em (B) aplica-se a (A).
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Discussion
Transferência de genes para a orelha do rato em desenvolvimento interior: A orelha do rato interior se desenvolve a partir da placode ótica durante a primeira semana de pós-implantação desenvolvimento 12,13. Por dia embrionário 9,5 (E9.5), o placode tem invaginado e se transformou em uma vesícula cheia de líquido chamado otocyst 2. Precursores óticos na vesícula dar origem às células sensoriais e não-sensorial dentro do ouvido interno madura, bem como os neurónios que inervam células ciliadas mecanicamente sensíveis nos epitélios vestibular e auditivo sensorial. No final de estádios de desenvolvimento embrionário, o complexo, morfologia 3-dimensional do labirinto membranoso do ouvido interno é estabelecida 3,12. Ganho e perda de função-modalidades experimentais são normalmente realizadas por transgênese do mouse para obter insights sobre a regulação genética dos processos de desenvolvimento, tais como especificação célula destino e formação de padrões. Manipulação genética dinâmica da orelha do rato em desenvolvimento interior naútero representa uma abordagem complementar ao transgênese rato que os casais técnicas de transferência de genes com o mouse experimental embriologia 6,11.
-Vírus e electroporação mediadas técnicas de transferência de genes têm sido desenvolvidos para manipular a expressão do gene na orelha desenvolvimento interior 6,11,14,15. Virais adeno-associados (AAV) vectores de infectar células progenitoras óticos que dão origem a tipos de células sensoriais e não-sensorial e têm sido utilizados para interrogar a base molecular de cálcio-dependente exocitose em células de ratinho de cabelo 16. Vectores de AAV produzir altos títulos que permitem a expressão ampla no ouvido interno e diferentes serotipos virais exibir tropismo única que pode ser vantajoso para a expressão celular diferencial. As desvantagens incluem uma capacidade de enchimento fixo que limita o tamanho do gene que pode ser misexpressed ea exigência de perícia para fazer virológica, purificar e titulação dos vírus. Electroporação mediada-tr geneansfer tem sido utilizado para avaliar o papel de um factor de transcrição de base hélice-alça-hélice na especificação destino da célula sensorial cabelo in vivo 6. Plasmídeos de expressão adaptadas para a tecnologia de subclonagem Gateway de permitir que a construção rápida e eficiente dos vectores com os promotores únicas dirigir a expressão de um gene de interesse e uma proteína marcador fluorescente de uma sequência IRES 17. Genes de interesse podem ser expressos em precursores óticos dentro de 24 horas de electroporação e expressão pode persistir na orelha pós-natal interior dependendo do promotor utilizado. Construção do plasmídeo, a purificação, concentração e quantificação requerem apenas padrão moleculares habilidades biológicas. As desvantagens incluem diminuição na eficiência de transfecção in vivo como aumenta o tamanho de plasmídeo acima 8kb ~ e uma maior taxa de letalidade embrionária em comparação com vectores mais virais. Tanto a eletroporação e vírus mediadas técnicas de transferência de genes de dominar rato experimental embriológico tecnologianicas: cirurgia sobrevivência, na manipulação de útero de embriões, e microinjeção transuterina. O objetivo deste artigo é abordar a questão última, demonstrando cada etapa crítica metodológica por meio de microscopia de vídeo digital.
Notas metodológicas sobre o vídeo: Nós deliberadamente optou por não armar o local da incisão com campo estéril durante as filmagens para que o espectador podia ver a posição da linha média ventral em relação à anatomia da barragem, ou seja, a cabeça (deliberadamente borrada mais em quadros, mas reconhecíveis), membros e cauda. Drapejando no local da incisão efetivamente bloqueia essa visão e podem confundir os esforços para apreciar espacialmente relevantes relações anatômicas durante a laparotomia ventral e uma sequência de injecção. No entanto, recomendamos draping o abdômen da barragem para que o resto exteriorizada cornos uterinos em um campo estéril para manter a assepsia cirúrgica. Além disso, nós deliberadamente não tentar demôniostrar sutura das incisões cirúrgicas na parede abdominal e pele, porque esses métodos devem ser aprendidas por orientação especializada de um médico veterinário ou técnico cirúrgico qualificado. Dr. Marcel I. Perret-Gentil (Universidade do Texas em San Antonio), apresenta uma excelente discussão deste tópico, completo, com representações pictóricas, em seu folheto, "Princípios de Sutura Veterinária" 18.
Recomendações processuais: transferência de genes para o ouvido do rato em desenvolvimento interno é tecnicamente desafiador. Há uma série de melhores práticas que irá eliminar uma quantidade substancial de variabilidade e garantir bons resultados. Fazemos recomendações específicas a seguir para facilitar o aprendizado desta abordagem experimental.
Consulte o pessoal veterinário para desenvolver o mouse sobrevivência cirurgia protocolo de atendimento animal: O protocolo de cuidados com animais para a cirurgia sobrevivência dos mamíferos é exigente para produzir desdecuidados de analgesia, anestesia, e peri-operatória deve ser definida e coordenada. Uma discussão detalhada do animal desenvolvimento protocolo de atendimento, incluindo a linguagem, que pode formar o núcleo do protocolo de um candidato, é fornecido como informações suplementares (ver " Cuidados Com Animais Protocolo de Desenvolvimento "). Além disso, as instituições de sua casa Cuidados dos Animais e do Comitê de Uso (IACUC) e do pessoal veterinário, sem dúvida, fornecer orientações adicionais sobre a formulação de um protocolo adequado, mediante solicitação.
Estabelecer um dedicado rato área da cirurgia de sobrevivência para a transferência de genes in utero: laparotomia ventral é um classificado como uma cirurgia de grande porte porque compromete uma cavidade do corpo. A maioria dos IACUCs não irá exigir uma estéril, 100 ambiente de classe para cirurgia de grande porte do mouse sobrevivência. Em vez disso, uma área dedicada que inclui iluminação adequada, ventilaçãomento, aquecimento suplementar, e duro, não porosas, superfícies desinfetáveis provavelmente será necessária. Nós preferimos a conduzir a nossa cirurgia sobrevivência em um capô horizontal de fluxo laminar, que protege o mouse de infecção, reduz o stress fisiológico, e, assim, a recuperação pós-operatória instalações. Nós definimos uma série de modificações feitas sob encomenda para uma oscilação amortecida-capela de fluxo, horizontal laminar (Envirco 630 LF) que incluem direcional, baixa potência de iluminação da trilha do halogênio; circuito elétrico expandido para poder equipamentos de transferência de gene, e tomadas elétricas embutidas com recortes de bancada para passagem do cabo. Um esquema detalhado dessas modificações são fornecidas como informação suplementar (ver " capela de fluxo laminar In Utero Transferência Gene "). Consulte o seu IACUC como você desenvolve o seu protocolo de atendimento animal para definir um local adequado que se dedica exclusivamente ao mouse survival cirurgia.
Pesar a barragem com a aproximação de 0,1 grama antes da administração de anestesia pentobarbital de sódio: pentobarbital de sódio é um anestésico eficaz e irá fornecer, pelo menos, 105 minutos de tempo de trabalho quando o esquema de dosagem recomendada é seguido. Determinar um peso corporal precisas para cada barragem antes de calcular a dose da mistura anestésico para injectar. Nunca estimar o peso de corpo da barragem. Use a Alergia agulha e seringa Seringa Bandeja do Becton Dikison: o bisel humano intradérmica é ideal para atraumáticas injeções intraperitoneais em camundongos grávidas. Além disso, esta seringa tem um volume de espaço morto extremamente baixo e é calibrado para a gama de volumes anestésicos tipicamente necessários para barragens cujos embriões são em E11.5 ou E12.5.
Implantar analgesia profilática para apoiar a sobrevivência embrionária: Administrar um anestésico tópico na linha de sutura, comoBupivicaine, e um sistêmico, não-esteróides anti-inflamatórias, tais como Meloxicam, antes de colocar a barragem na gaiola de recuperação para que os analgésicos são a bordo no momento em que a barragem se recupera da anestesia. Reduzir o desconforto na represa facilita a recuperação pós-operatória e manutenção de uma gravidez saudável.
Bevel pipetas a microinjeção e firmemente limitam o diâmetro externo: A causa mais comum de letalidade embrionária é um tecido e / ou dano vascular de microinjecção pipetas mal construída. Microinjeção transuterina no mouse E11.5 otocyst carrega diferentes restrições do que a injeção em órgãos maiores em embriões mais velhos (ou seja, vesículas cerebrais, oculares, membros, etc.) Unbeveled, mal chanfrado, ou inapropriadamente grandes pipetas diâmetro externo vai causar sangramento de vasos do útero, o saco vitelino visceral vasculatura e / ou do embrião em E11.5, que irá diminuir a sobrevivência embrionária. É possívelmão-quebrar pipetas duráveis de pequeno diâmetro que transportam um bisel adequado, mas é difícil para o fazer de forma rotineira. O embrião de rato E11.5, cuja pequena otocyst é o alvo, será implacável. Consulte o P-1000 P-97 Cookbook Pipetar 2011 de Instrumentos Sutter para um discurso cheio de pipeta de projeto e fabricação 19. Parâmetros para as pipetas utilizadas neste trabalho são anotados acima e sua fabricação foi totalmente discutido anteriormente 11. As notas processuais no manual do proprietário para a Sutter beveler Instruments BV-10 são também um excelente recurso.
Entenda por que o mistargeting otocyst por microinjeção transuterina ocorre: O vídeo apresenta o resultado ideal para microinjeção transuterina na E11.5 e E12.5 otocyst. Mistargeting o otocyst geralmente resulta de injeção muito superficial, muito profundamente, ou de pipetas inadequadamente fabricados. A Figura 2 demonstra estas condições. PainelA mostra uma vista lateral do lado esquerdo de um embrião E12.5 fotografada por transiluminação após microinjecção transuterina bem sucedida de solução verde rápido para a otocyst. O cérebro posterior (Hb) aparece como uma dorsal entalhe em forma de cunha para o otocyst. O olho (e) tem um anel de pigmento ao longo da sua periferia e do membro anterior esquerdo é proeminente. O tronco principal da veia cabeça primária (PHV) está logo abaixo da otocyst. O otocyst está cheio de verde rápido que parece negro: o dorsal, ducto endolinfático (ed) e no vestíbulo do otocyst (oc) podem ser discernidos. Segmentação bem-sucedida do-12.5 E11.5 otocyst sempre apresentar um ducto endolinfático claramente discernível e vestíbulo. Painel A 'mostra a mesma imagem, como em A, sem a rotulagem branco para facilitar a revisão crítica da otocyst injetado.
Figura 2. Um guia ilustrado para mistargeting o otocyst por transuterina microinjecção. Todos os painéis mostram a vista lateral esquerdo de um embrião E12.5 com mesencéfalo-se e à esquerda do prosencéfalo, excepto Painel H, que é uma vista dorsal da região do mesencéfalo rombencéfalo. Painéis em cada linha representar imagens do mesmo embrião. Veja a discussão para uma explicação detalhada das causas da mistargeting otocyst. Abreviaturas: e, olho esquerdo, ed, endolinfático conduta; fg, rápido verde, hb, rombencéfalo; lb, membro botão; oc, otocyst; ot, território ótica; p, pipeta; PHV, veia cabeça primária, pt, ponta da pipeta.
Injeção superficial é uma causa comum de mistargeting. Painéis SER demonstrar uma injeção superficial nas E12.5 concepto. O rombencéfalo entalhe (HB) e no território ótica (ot, círculo) são evidentes nessa visão, lateral esquerdo. A pipeta microinjecção (p) é em primeiro plano. Rápido verde (fg) começa a ejectar a partir da ponta da pipeta (B), e com pulsos subsequentes de a pressão do injector (CD), os corantes difunde em uma forma oval. A distribuição de thcorante e sugere que ela foi introduzida entre a parede uterina ea visceral saco vitelino, uma membrana extra-embrionário que envolve a cavidade exocoelomic. O pesquisador não deve tentar re-direcionar o otocyst neste embrião, mas deve passar para a próxima embrião. Múltiplas injeções correlacionar com a diminuição da sobrevivência embrionária, um efeito que é mais aguda do que em E11.5 E12.5.
Injecção em profundidade é uma causa mais comum de mistargeting. Painéis FH demonstrar uma trajectória de injecção, que passa através do território ótica no cérebro posterior. A veia cabeça primária (PHV), olho esquerdo (e), e pipeta (p) são evidentes nesta vista lateral de um embrião E12.5. A ejecção inicial de rápida verde (fg) é deslocado dorsalmente com respeito à veia cabeça primário / território ótica. Com pulsos subseqüentes, a parte posterior do cérebro em forma de cunha (Hb) foi completamente preenchido com verde rápido (Painel G). A rotação de 90 graus do embrião injetado permite a detecção de verde rápido dentro do hindbrana cavidade a partir da vista dorsal (Painel H). Ambos superficial e profundo resultado injecções da incapacidade de perceber a profundidade da pipeta microinjecção depois faz contacto com o útero. Uma abordagem prática que funciona bem é avançar a pipeta através do útero e, em seguida, imediatamente pulsar uma vez para procurar uma baforada de verde rápido: a localização do sopro indica a posição aproximada da ponta da pipeta. Ajuste a profundidade com base nesse pulso telemetria.
Pipetas inadequadamente fabricados são a causa mais comum de mistargeting. A tentativa de injecção em Painéis IK foi realizado com uma ponteira que foi quebrado, mas não manualmente chanfradas. A vista lateral do embrião E12.5 mostra a parte posterior do cérebro (Hb), olho esquerdo (e), e da pipeta microinjecção (p). Note-se que a ponta da pipeta (pt) é fortemente inclinada e não conseguiu penetrar no útero (painel I). Aplicação de força adicional tesouras a ponta da pipeta (Painel J, seta), deixando o pipette ponta incorporado no útero. Uma pequena quantidade de rápida verde (fg) foi ejectado a partir da pipeta fracturada e manchou a superfície do útero. O embedded pipeta (Painel K) deve ser removido com multa, pinças esterilizadas e descartadas como resíduos perfurocortantes. Se a ponta da pipeta não pode ser localizada ou removidos com sucesso, euthanize da barragem, sob anestesia.
Documentar observações processuais em uma folha de sobrevivência cirurgia rato de dados: Um elemento crucial para a aprendizagem desses métodos é documentar observações e fazer os ajustes com base nessas observações. Produzir um rato sobrevivência cirurgia folha de dados e anotar informações pré-operatório, operatório e pós-operatório. Dados pré-operatórios incluem peso barragem, dose de anestésico entregue, injectado plasmídeo, etc dados operatórios incluem a injecção de embrião (ie, R2 é o embrião segundo a partir do ovário no corno uterino direito), a qualidade da injecção (ie, sem endolinfática duto detectado, corante em 4
Usam corrente fornecida por pulso para otimizar a eficiência de transfecção: O trem de pulso de onda quadrada é composta de 5, 43volt, leguminosas 50msec com uma inter 950msecatraso de pulso. A platina 5 milímetros, os eléctrodos de estilo de pás assegurar que todo o território ótica está contido dentro do campo eléctrico. Eficiências de transfecção semelhante pode ser alcançado com pás de 3mm, embora eles são mais difíceis de posicionar com precisão. O paradigma de pulso foi optimizada através da avaliação da corrente transferida para o embrião durante o impulso final, não por varrendo tensões e avaliação da eficiência de transfecção. O raciocínio é que a corrente fornecida por pulso varia em tensão constante, dependendo da permeabilidade do acoplamento elétrico entre o útero e os eletrodos de platina. Assumindo que o útero é recém-irrigado com uma solução de Ringer com lactato imediatamente antes da colocação das pás e carga transportadora está presente em excesso, a variável principal é a quantidade de "acoplamento" pressão aplicada para o útero com as pás. Pressão suave em 43volts resultados em 60mAmps <de transfecção entregue e esporádica atual na melhor das hipóteses. Pressão moderada a 43vOLTs resulta em 60-100mAmps entregue eo transfecção mais eficiente. Forte pressão em resultados 43volts em> 100mAmps entregue e se correlaciona com a freqüência cardíaca persistentemente alterada e aumentou a letalidade embrionária. A pressão excessiva rompe o saco vitelino visceral (a "pop" pode ser sentida através das pás) e faz com que a letalidade embrionária. É provável que a pressão variável aplicada altera a impedância entre os eléctrodos que afecta a corrente fornecida. A frequência de impulso de 1Hz (um pulso de 50 ms por segundo) foi definida como a, pelo menos prejudicial para o ciclo cardíaco do embrião, o que é um positivo correlacionar para a sobrevivência embrionário. Concluímos que o parâmetro mais importante para monitorizar no estabelecimento de uma eficiente paradigma in vivo electroporação é a corrente fornecida por pulso. Modificação de qualquer paradigma de pulso deve incluir monitorização cuidadosa da corrente fornecida por pulso.
Adoptar uma abordagem modular para a aprendizagem ªe técnica: Módulo 1: Pratique uma cirurgia fictícia com exteriorização do útero, mas não injetar ou electroporate. Barragens tolerar laparotomia ventral muito bem e nunca deve experimentar complicações pós-operatórias relacionadas à técnica cirúrgica. Habilidades de sobrevivência rato cirúrgicos são, sem dúvida, residente na instituição de origem para prosseguir a formação adequada. Conseguir o domínio de habilidades cirúrgicas antes de prosseguir. Módulo 2: a microinjeção Prática transuterina no otocyst em uma represa de anestesiados sem a expectativa de completar a cirurgia de sobrevivência: a eutanásia da barragem sob anestesia, isolar os embriões injetados, e avaliar a qualidade das injeções otocyst. Módulo 3: Alvo apenas 2 otocysts em 2 embriões diferentes com verde rápido, não electroporate, completar a cirurgia, e validar a sobrevivência embrionária a jusante. Módulo 4: alvo apenas 2 embriões com DNA / solução de verde rápido, electroporate, validar a sobrevivência embrionária a jusante, e verificar a transfecção efficiency. Módulo 5: Alvo apenas 2 embriões com DNA / solução de verde rápido, electroporate, injetar Alexa Fluor para o ventrículo 4 a rotular o embrião manipulado, selecionar embriões marcados em P0, e eficiência da transfecção verificar.
Curva de aprendizagem processual: Domínio das técnicas de cirurgia do mouse de sobrevivência, com a orientação adequada do pessoal veterinário e cirúrgico de sua instituição de origem, é bastante rápido e só deve exigir 3-5 barragens de valor de prática para o novato para ganhar experiência. Microinjeção transuterina e em eletroporação in vivo para gerar útil transfectadas ouvido interno exigirá 10-50 barragens-estima de esforço, assumindo que há 6 embriões viáveis por gravidez ea abordagem modular é seguido. Os alunos que gostam de atividades que requerem habilidades motoras finas (ou seja, tocar um instrumento musical, de costura, modelo de decisões, ou as competições atléticas) têm períodos mais curtos de treinamento que thosi mesmo que não o fazem. Os correlatos críticos para o domínio de sucesso destes métodos são escrupulosa atenção aos detalhes (ou seja, a microinjeção pipeta de fabricação, anatomia vascular, explícita anotações) e um comportamento razoavelmente calmo.
Fluxo de Trabalho: Uma vez que se ganha experiência, se pode antecipar o baque e electroporating 4-6 embriões por barragem; 3-5 embriões irão sobreviver, e 2-4 embriões terá útil transfectadas ouvidos internos para análise. O rombencéfalo Alexa Fluor técnica para rotulagem de etiquetas para classificar embriões ao nascimento requer a injeção rombencéfalo adicional em cada embrião eletroporados, mas isso é bem tolerado e não prejudique a eficiência processual. Assim, a taxa de recuperação de útil transfectadas orelhas internas de eletroporação in vivo em compara favoravelmente com a taxa de recuperação de ratos mutantes homozigotos de um paradigma de reprodução heterozigose. Com a experiência, por 2-3 barragens experimentador por dia é um trabalho razoávelfluxo: 1,5 horas por barragem para a cirurgia e um total de 1,5-2 horas para acompanhamento pós-operatório.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Imprensa Humana permissão para publicar a microinjeção figura fabricação pipeta que apareceu originalmente na página 130 da referência 11; Larry Dlugas e Steven Wong, OHSU Departamento de Comunicações Educacionais, para videografia; Larry Dlugas para vídeo design e edição; Adam M. O 'Quinn, Designer Sênior, Trion / Envirco para projetar nossa capela de fluxo laminar horizontal personalizado e Les Goldsmith para fornecer o esquema técnico; Victor Monterroso, MV, MS, PhD e Tom Chatkupt, DVM, OHSU Departamento de Medicina Comparada, para orientação com a nossa animais protocolo de atendimento, técnicas cirúrgicas e analgesia profilática regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, para partilhar a sua apostila sobre técnicas de sutura veterinários; Edward Porsov, MS, para projetar nossa Adobe Premiere Pro vídeo estação de trabalho do computador microscopia, e Leah e Branco Jonas Hinckley de LNS Caption (Portland, OR). Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Surdez e outrDistúrbios r Comunicação: DC R01 008.595 008.595 R01 e DC-04S2 (JB) e P30 DC005983 (Audição do Oregon Research Center Núcleo Grant, Peter Gillespie, Investigador Principal).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
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