Summary
Musen indre øret er en placode-avledet sanseorgan som utviklingsmessig programmet er utdypet under svangerskapet. Vi definerer en
Abstract
Hos pattedyr indre øret har seks distinkte sensorisk epitel: 3 cristae i ampullae av den halvsirkelformede kanaler, maculae i utricle og saccule, og orgelet av Corti i coiled cochlea. Den cristae og maculae inneholde vestibulære hårcellene som transduce mekaniske stimuli til subserve den spesielle følelsen av balanse, mens auditive hårcellene i organ Corti er de primære transdusere for å høre en. Cell skjebne spesifisering i disse sensorisk epitel og morphogenesis av den halvsirkelformede kanaler og cochlea skje i løpet av andre svangerskapsuke i mus og er stort sett ferdig før fødselen 2,3. Utviklingsmessige studier av mus indre øret blir rutinemessig utført ved å høste transgene embryo på ulike embryonale eller postnatal stadier å få innsikt i det molekylære grunnlaget for cellulær og / eller morfologiske fenotyper 4,5. Vi hypotese at genoverføring til å utvikle musen indre øret i fosterlivet </ Em> i sammenheng med gevinst-og tap-av-funksjon studier representerer en gratis tilnærming til tradisjonell mus transgenesis for avhør av de genetiske mekanismene bak pattedyrs indre øret utvikling seks.
Den eksperimentelle paradigmet å gjennomføre genet misexpression studier i utviklingsland mus indre øret demonstrert her løser inn i tre generelle trinn: 1) ventral laparotomi, 2) transuterine mikroinjeksjon, og 3) in vivo electroporation. Ventrale laparotomi er en mus overlevelse kirurgisk teknikk som tillater eksternalisering av livmoren for å få eksperimentell tilgang til de implanterte embryoer 7. Transuterine mikroinjeksjon er bruk av skrå, glass kapillær mikropipetter å introdusere uttrykket plasmid inn i lumen av otic vesikkel eller otocyst. In vivo electroporation er anvendelsen av firkantbølge, direkte strømpulser å kjøre uttrykk plasmid inn progenitorceller 8-10.
11. Mus eksperimentelle embryologiske teknikker kan være vanskelig å lære av prosa og stillbilder alene. I dette arbeidet, viser vi de 3 trinnene i genoverføring prosedyren. Mest kritisk, distribuere vi digital video mikroskop for å vise nøyaktig hvordan du: 1) identifisere embryo orientering i utero, 2) reorientere embryoer for målretting injeksjoner til otocyst, 3) microinject DNA blandet med sporstoff dye løsning i otocyst på embryonale dager 11,5 og 12,5, 4) electroporate den injiserte otocyst, og 5) label electroporated embryoer for postnatal utvalg ved fødselen. Vi tilbyr representative eksempler på vellykket transfekterte indre ører, en billedlig guide til de vanligste årsakene til otocyst mistargeting, drøfte hvordan man kan unngå vanlige metodiske feil, og nåværende retningslinjer for å skrive en in utero gene transfer dyr omsorg protokollen.
Protocol
1. Ventrale laparotomi
- Anesthetize en demning som embryo er på embryonale dag 11,5 (E11.5, middag på dagen en vaginal plugg blir oppdaget er dag 0,5 av embryoutvikling) ved intraperitoneal injeksjon av natrium pentobarbital bedøvelse løsning (7,5 mL per gram kroppsvekt). Arbeid bedøvelse løsning: 180 mL av 50 mg / ml pentobarbital natrium løsning; 100 mL av absolutt etanol, 320 mL av 65 mg / ml vandig magnesium sulfat (modulerer livmor tone), og 400 mL av propylenglykol (kjøretøy blandbar med vandig og organisk komponenter).
- Vurdere fullstendigheten av anestesi ved å gjennomføre skadelige stimuli tester: labb klemme, hale knipe, og blinking respons på kinnet og vibrissae touch. Bruk sterile ophthalmic sårsalve til hornhinner.
- Barbere abdominal pels fra suprapubisk området til brystkassen med hagesaks og en fin stamme (Oster # 40 blad). Desinfiser magen med 70% etanol, 10% povidon jod (Betadine), ennd 70% etanol, sekvensielt. Plasser mus magen-side ned på et sterilt drapere og deretter satt på en oppvarming puten eller varmt fat (37 ° C) i 2-5 minutter.
- Incise abdominal hud i ventrale midtlinjen med ball-tipped saks. Utvid snittet for 10-14 mm. Identifiser linea alba, en avaskulær, hvit bindevev bandet langs ventrale midtlinjen av bukveggen. Incise linea alba med ball tippet saks og utvide snittet 10-14 mm. Umiddelbart vanne magen med prewarmed (37 ° C) Ringer-laktat oppløsning.
- Externalize de to hornene på livmoren med ring tang uten å bruke høyt trykk på implantasjoner. Skyll de eksternaliserte livmor horn med prewarmed, Ringer-laktat oppløsning.
2. Transuterine mikroinjeksjon
- Dikte en tykkvegget, borsilikatglass kapillær mikroinjeksjon pipette med følgende egenskaper: 12-16 μm ytre diameter og en 20-graders skråkant. På en Sutter P-97 pipette avtrekker med liten boks filament, bruker du følgende program: varme = rampe test pluss 3 enheter; press = 200; trekk = 0; hastighet = 46; time = 100). Med Sutter BV-10 beveler, bruker 104C (gull) slipende disk for stor diameter pipetter. Resuspender uttrykk plasmidet på 3-4 mikrogram / mL i kalsium fritt fosfat saltløsning (pH 7.2 til 7.4). Legg krystallinsk fast grønt til konsentrert DNA, vortex forsiktig i 30 sekunder, og spinner på 10 000 g for 10 sekunder. Det minimum av fast grønt er nødvendig for å visuelt spore effekten av injeksjonen bestemmes empirisk. Etterfylle den skrå pipetten med DNA / rask grønn løsning. Koble den lastede mikroinjeksjon pipetten til pipetten innehaveren av trykket injektoren (Picospritzer hjelp> 99% ren nitrogen som kilde gass).
- Transilluminate livmoren med lav intensitet, halogen lys til å visualisere fosteret innenfor sin implantasjonsstedet. Identifiser beaTing hjerte, hjerne blemmer, lem knopper, begynnende 4. ventrikkel i hindbrain og øye. Skyll livmoren hver 2 minutter med prewarmed og Ringer-laktat oppløsning for å unngå uttørking. Påfør forsiktig press på livmoren for å reorientere fosteret og identifisere anatomiske landemerkene nevnt ovenfor.
- Orient fosteret å identifisere den primære hodet venen som fremre og bakre grener flankerer mesenchymale territorium der otocyst bor. Den otocyst riktig kan ikke ses av transillumination av livmoren. Den otocyst ligger midtveis mellom fremre og bakre grener av det primære hodet blodåre som sammen med de viktigste stammen av venen, danner formen av støttene eller goalposts på en amerikansk fotballbane. Den otocyst er midtveis mellom støttene.
- Sett injeksjonen pipetten gjennom livmoren i en bane i tråd med presumptive plasseringen av otocyst. Pulse microinjector gang etter å ha passert gjennom uteross å visualisere tracer fargestoff og omtrentlig plassering av pipettespissen. Advance pipetten henhold mikrometer kontroll og pulsere igjen for å vurdere dybde. Videre avansere pipetten inn i laterale hodet mesenchyme og puls flere ganger. Vellykket otocyst målrettingen vil avsløre den koniske formen på Endolymphatic kanal dorsally og kamskjell-formen vestibylen. Slipp press på livmoren, fjerne pipetten fra embryo / livmor i en bevegelse, og straks vanne livmoren med prewarmed, Ringer-laktat oppløsning.
3. In vivo electroporation
- Skyll livmoren med Ringer-laktat oppløsning. Fersk søkt Ringer-laktat oppløsning er nødvendig for å elektrisk par de padle-stil elektroder til livmor. Fukt tungsten flater av elektroder med Ringer-laktat. Sentrer injisert otocyst i banen av elektrodene. Forsiktig komprimere uterus med electroporation paddles. Katoden er i kontakt med livmorveggen lateral til injisert otocyst og anoden er i kontakt med livmorveggen ved siden av uninjected otocyst. Utløse en firkantet bølge pulstog med fotpedalen bryteren på electroporator. Electroporation parametrene er: 5, 50 ms pulser på 43 volt per puls og en 950 msek interpulse forsinkelse. Umiddelbart vanne livmoren etter at pulstog er levert. Ta opp dagens levert til vev: 60-100 mAmps er tilstrekkelig til å transfektere otic epiteliale stamfedre. Injisere og electroporate 4-6, E11.5 embryoer per dam.
- Utfør en andre, uavhengig transuterine mikroinjeksjon av vandig fluorescerende dekstran (Alexa Fluor 488 hvis uttrykket plasmidet koder for et rødt fluoriserende protein eller Alex Fluor 594 hvis uttrykket plasmidet koder for et grønt fluorescerende protein) i 4. ventrikkel av disse embryoene hvis indre ører er nøyaktig injisert og minst 60 mAmps av nåværende pr puls var delivered under electroporation. Den fluoriserende dekstran vil være synlig ved fødselen i hindbrain og muliggjøre valg av unger som indre ørene ble manipulert under embryogenese (se 3.5).
- Skyll livmor horn med Ringer-laktat. Sett livmor hornene inn i bukhulen. Skyll livmorhulen med 2-4 ml av prewarmed, Ringer-laktat oppløsning og la overløp renne ut av såret nettstedet på sterile drapere. Erstatt drapering med tørt, sterilt utstyr. Suture bukveggen med en ikke-skjærende nål og en 6-0 resorberbart sutur. Vi foretrekker en løpende søm, låsing annenhver maske, for både bukveggen og huden.
- Tørk dammene 'Choice pels og administrere et ikke-steroid anti-inflammatorisk som Meloksikam ved subkutan injeksjon. Tilbake demningen til prewarmed utvinning buret på et sterilt drapere. Overvåke og registrere demninger 'Choice respirations og snitt nettstedet patency og vagina for blodig utflod. Blødning er rare men hvis tilstede og med uforminsket styrke, avlive demningen mens hun fortsatt er under narkose. Merk tiden hun gjenvinner bevisstheten og forsøk på å ambulate. Tilbake demningen til musen kolonien når hun viser tegn på å spise og drikke og har begynt å hekke bygge. Vanligvis skjer dette innen 12 timer.
- Ved fødselen (postnatal dag 0), setter flash hindbrain regionen hver valp i kullet å oppdage fluorescerende dekstran ved hjelp av en stereofluorescence dissekere mikroskop med en GFP eller Texas Red filter som passer. Gå tilbake til lakterende dammen bare de valpene som viser hindbrain merking.
4. Representative Resultater
Figur 1. Electroporation-mediert genoverføring til utviklingslandene cochlea. Den E11.5 otocyst ble injisert med et uttrykk plasmid koding forbedret grønt fluoriserende protein (EGFP) og electroporated (puls ekstrai parametere: fem, 43 volts pulser på 50 ms / puls og 950 msek interpulse forsinkelse). A) En representant indre øret fra en postnatal dag 6 (P6) valp hvis otocyst ble injisert og electroporated på E11.5 demonstrere EGFP uttrykk fra basen gjennom midten begynnelsen av sneglehuset. Den laterale vegg av sneglehuset ble fjernet fra midten turn og apex bare. E11.5 stamfedre som gir opphav til apex ble ikke tilført. B) Hele mount farging av sneglehuset i (A) med håret celle markør, indikerer myosin 7a (Myo7a), som EGFP uttrykket følger banen organ Corti og er grovt lokalisert til håret celle-bærende sensorisk epitel. C) En representant indre øret fra en E18.5 embryo som otocyst ble injisert og electroporated på E11.5. Laseren confocal Anslaget viser EGFP uttrykk i Myo7a-positive sensoriske hårceller. D) Laser confocal projeksjon av sneglehuset sensorisk epitel fra E18.5 organ Corti indikerer EGFP expression i de indre hårcellene (IHC), ytre hårcellene (OHC), indre phalangial celler (IPC), søyle celler (PC), og Deiters 'celler (DC). Skalaen bar i (B) gjelder (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genoverføring til å utvikle musen indre øret: Musen indre øret utvikler seg fra otic placode løpet av den første uken av fostertap utvikling 12,13. Ved embryonale dag 9,5 (E9.5) har placode invaginated og morphed inn i en væskefylt vesicle kalt otocyst to. Otic forløpere i vesicle gi opphav til de sensoriske og nonsensory cellene i modne indre øret samt nevroner som innerverer mekanisk sensitive hårcellene i det vestibulære og auditive sensoriske epitel. Ved slutten av embryonale stadier, er komplekse, tre-dimensjonale morfologi av membranous labyrinten i det indre øret etablert 3,12. Gevinst-og tap-av-funksjon eksperimentelle modaliteter vanligvis utføres av musen transgenesis å få innsikt i den genetiske reguleringen av utviklingsprosesser som celle skjebne spesifikasjon og mønster formasjon. Dynamisk genetisk manipulering av å utvikle musen indre øret iutero representerer en gratis tilnærming til mus transgenesis at par genoverføring teknikker med musa eksperimentell embryologi 6,11.
Virus-og electroporation-mediert genoverføring teknikker har blitt utviklet for å manipulere genuttrykket i utviklingsland indre øret 6,11,14,15. Adeno-tilknyttede viral (AAV) vektorer infisere otic stamfedre som gir opphav til sensoriske og nonsensory celletyper og har blitt brukt til å avhøre den molekylære basisen for kalsium-avhengige eksocytose i mus hårcellene 16. AAV vektorer produsere høye titer som muliggjør bred uttrykk i det indre øret og ulike virale serotyper viser unike tropisme som kan være fordelaktig for differensial mobilnettet uttrykk. Ulempene inkluderer en fast farse kapasitet som begrenser størrelsen på genet som kan misexpressed og kravet til virologisk kompetanse til å gjøre, rense, og titer virus. Electroporation-mediert genet transfer har blitt brukt for å vurdere betydningen av en grunnleggende helix-loop-helix transkripsjonsfaktor i spesifisere sensorisk håret celle skjebne in vivo 6. Expression plasmider tilpasset Gateway subcloning teknologi tillater rask og effektiv bygging av vektorer med unike arrangører kjører uttrykket av et gen-of-interesse og et fluoriserende fargestoff protein fra en IRES sekvens 17. Gener av interesse kan uttrykkes i otic forløpere innen 24 timer fra electroporation og uttrykk kan vedvare i postnatal indre øret avhengig av arrangøren brukt. Plasmid konstruksjon, renselse, konsentrasjon, og kvantifisering krever bare standard molekylærbiologiske ferdigheter. Ulempene inkluderer redusert in vivo transfeksjon effektivitet som Plasmid størrelse øker over ~ 8KB og en høyere rate av embryonale dødelighet sammenlignet med de fleste virale vektorer. Både electroporation-og virus-mediert genoverføring teknikker krever beherskelse av mus eksperimentell embryologiske technikker: overlevelse kirurgi, i utero manipulering av befruktede egg, og transuterine mikroinjeksjon. Målet med dette manuskriptet er å ta det siste spørsmålet ved å demonstrere hvert kritiske metodiske skritt digital video mikroskopi.
Metodeopplysninger på video: Vi bevisst valgte ikke å drapere snittet nettstedet med sterile feltet under innspillingen slik at betrakteren kan se plasseringen av ventrale midtlinjen i forhold til brutto anatomi av dammen, dvs. hodet (bevisst uskarp i de fleste rammer, men gjenkjennelige), lemmer, og hale. Draperinger snittet nettstedet blokkerer effektivt dette synet og kan forvirre arbeidet med å sette pris på romlig relevante anatomiske forhold i løpet av ventral laparotomi og en injeksjon sekvens. Vi anbefaler imidlertid draperinger buken av dammen slik at eksternaliserte livmor horn hvile på et sterilt felt for å opprettholde kirurgisk aseptikk. I tillegg har vi bevisst ikke forsøke å demonertrate suturering av de kirurgiske snitt i bukveggen og huden fordi disse metodene må læres ved kyndig veiledning av en veterinær eller kvalifisert kirurgisk tekniker. Dr. Marcel I. Perret-Gentil (University of Texas i San Antonio), presenterer en utmerket drøfting av dette emnet, komplett med billedlige representasjoner, i handout hans, «Principles of Veterinary suturering." 18
Prosessuelle anbefalinger: genoverføring til å utvikle musen indre øret er teknisk utfordrende. Det finnes en rekke beste praksis som vil eliminere en betydelig mengde av variasjon og sikre vellykkede resultater. Vi gjør konkrete anbefalingene nedenfor for å lette læring dette eksperimentell tilnærming.
Consult veterinær ansatte til å utvikle musen overlevelse kirurgi dyr omsorg protokoll: Dyret omsorg protokoll for pattedyr å overleve operasjonen er krevende å produsere sidenanestesi, analgesi, og perioperativ omsorg må defineres og koordineres. En detaljert diskusjon av dyr omsorg protokollen utvikling, inkludert språk som kan danne kjernen i en søkers protokoll, gis som supplerende informasjon (se " Animal Care Protocol Development "). I tillegg vil dine hjemme institusjonenes Animal Care og bruk Committee (IACUC) og veterinær personale utvilsomt gi ytterligere veiledning om utforming av en passende protokoll på forespørsel.
Etablere en egen mus overlevelse kirurgi område for i utero genoverføring: Ventral laparotomi er en klassifisert som en stor operasjon, fordi det svekker kroppens hulrom. De fleste IACUCs vil ikke kreve en steril, klasse 100 miljø for større mus overlevelse kirurgi. Snarere har en dedikert område som riktig belysning, ventilaning, supplerende oppvarming, og hardt, vil ikke-porøse og disinfectable overflater sannsynligvis være nødvendig. Vi foretrekker å utføre vår overlevelse kirurgi i en horisontal laminær hette som beskytter mus mot infeksjoner, reduserer fysiologisk stress, og dermed fasiliteter postoperativ utvinning. Vi har definert en rekke tilpassede modifikasjoner til en svingning-dempet, horisontal laminær hette (Envirco LF 630) som inkluderer retningsbestemt, lav wattstyrke halogen spor belysning; utvidet elektrisk krets til makten genoverføring utstyr, og innfelte stikkontakter med benk topp utsparinger for ledningen passasje. En detaljert skjematisk av disse endringene er gitt som supplerende informasjon (se " laminær Hood In Utero Gene Transfer "). Rådfør deg IACUC som du utvikler din dyr omsorg protokollen å definere et egnet sted som er dedikert utelukkende til mus survival kirurgi.
Vei dammen til nærmeste 0,1 gram før administrering av natrium pentobarbital anestesi: Natrium pentobarbital er en effektiv bedøvelse og vil gi minst 105 minutter av arbeidstiden når den anbefalte doseringsplan er fulgt. Bestem en nøyaktig kroppsvekt for hvert demning før beregne dosen av anestesiblanding å injisere. Aldri anslå demning kroppsvekt. Bruk Allergy sprøyte skuff nål og sprøyte fra Becton Dikison: den menneskelige intradermal bevel er ideell for Atraumatisk intraperitoneal injeksjon i gravide mus. Dessuten har denne sprøyten en ekstremt lav dødrom volum og er kalibrert for omfanget av bedøvende volumer vanligvis kreves for dammer som embryo er på E11.5 eller E12.5.
Distribuer profylaktisk smertelindring å støtte embryonal overlevelse: administrere en aktuell bedøvelse på sutur linje, for eksempelBupivicaine, og en systemisk, ikke-steroide anti-inflammatorisk narkotika, for eksempel Meloksikam, før plassere dammen i utvinningen buret slik at smertestillende er om bord av gangen demningen gjenoppretter fra anestesi. Redusere ubehag i dammen forenkler postoperativ rehabilitering og vedlikehold av en sunn graviditet.
Fasvinkel mikroinjeksjon pipetter og tett begrense ytre diameter: Den vanligste enkeltstående årsaken til embryonale letalitet er vev og / eller vaskulære skader fra dårlig konstruert mikroinjeksjon pipetter. Transuterine mikroinjeksjon i E11.5 musen otocyst gjennomfører ulike begrensninger enn injeksjon i større organer i eldre embryoer (dvs. hjernen blemmer, øye, lem, osv.). Unbeveled, dårlig avskårne eller uhensiktsmessig store ytre diameter pipetter vil føre til blødning fra fartøy i livmoren, den viscerale plommesekken blodkar, og / eller embryo ved E11.5, noe som vil redusere overlevelse av embryo. Det er muligfor hånd bryte holdbare pipetter av liten diameter som bærer en passende skråkant, men det er vanskelig å gjøre det rutinemessig. Den E11.5 mus embryo, hvis lille otocyst er målet, vil være utilgivelig. Konsultere P-1000 P-97 Pipetter Cookbook 2011 fra Sutter Instruments for en full utlegning av pipette design og fabrikasjon 19. Parametere for pipetter som brukes i dette arbeidet er beskrevet ovenfor, og deres bearbeiding er fullt diskutert tidligere 11. De prosessuelle notater i brukerhåndboken for Sutter Instruments BV-10 beveler er også en utmerket ressurs.
Forstå hvorfor mistargeting den otocyst ved transuterine mikroinjeksjon skjer: Videoen presenterer den ideelle utfallet for transuterine mikroinjeksjon i E11.5 og E12.5 otocyst. Mistargeting den otocyst resulterer vanligvis fra injisere for overfladisk, for dypt, eller fra utilstrekkelig fabrikkerte pipetter. Figur 2 viser disse forholdene. PanelA viser en lateral syn på venstre side av en E12.5 embryo fotografert av transillumination etter vellykket transuterine mikroinjeksjon av rask grønn løsning i otocyst. Den hindbrain (HB) vises som en kile-formet hakk dorsal til otocyst. Øyet (e) har en ringrommet av pigment langs sin periferi og venstre forbena er fremtredende. Den største stammen av den primære hodet venen (PHV) er rett under otocyst. Den otocyst er fylt med rask grønn som vises svart: dorsal, kan Endolymphatic duct (ed) og vestibyle av otocyst (OC) skjelnes. Vellykket satsing på den E11.5-12.5 otocyst vil alltid presentere en klart merkbar Endolymphatic kanal og vestibylen. Panel A 'viser det samme bildet som i A uten hvit merking for å lette kritisk gjennomgang av den injiserte otocyst.
Figur 2. En malerisk guide til mistargeting den otocyst ved transuterine microinjecsjon. Alle paneler viser venstre laterale visning av en E12.5 embryo med midbrain opp og forebrain venstre, bortsett Panel H, som er en dorsal utsikt over hindbrain-midbrain regionen. Paneler i hver rad representerer bilder av samme embryo. Se diskusjonen for en detaljert forklaring av årsakene til otocyst mistargeting. Forkortelser: E, venstre øye, ed, Endolymphatic duct, fg, rask grønn, HB, hindbrain, lb, lem knopp, OC, otocyst, ot, otic territorium, p, pipette, PHV, primær hode vene, pt, pipettespissen.
Overflatisk injeksjon er en vanlig årsak til mistargeting. Paneler BLI demonstrere en overfladisk injeksjon i E12.5 conceptus. Den hindbrain (HB) hakk og otic territorium (OT, sirkel) er tydelig i denne venstre, delvis utsikt. Den mikroinjeksjon pipette (p) er i forgrunnen. Fast grønn (FG) begynner å løse ut fra pipettespissen (B), og med påfølgende pulser fra trykket injektoren (CD), fargestoffet diffunderer inn i en oval-form. Fordelingen av the fargestoff tyder på at det ble innført mellom livmorveggen og visceral plommesekken, en extraembryonic membran som omslutter exocoelomic hulrom. Det eksperimentator bør ikke forsøke å re-målrette otocyst i denne embryo, men bør gå videre til neste embryo. Flere injeksjoner korrelerer med redusert overlevelse av embryo, en effekt som er mer akutt på E11.5 enn E12.5.
Deep injeksjon er en mer vanlig årsak mistargeting. Paneler FH demonstrere en injeksjon banen som går gjennom otic territorium i hindbrain. Den primære hode vein (PHV), venstre øye (e), og pipette (p) er tydelig i denne lateral visning av en E12.5 embryo. Den første utstøting av rask grønn (FG) er fortrengt dorsally med hensyn til den primære hodet venen / otic territorium. Med påfølgende pulser ble kileformet hindbrain (HB) helt fylt med rask grønn (Panel G). En 90 graders rotasjon av injisert embryo tillater påvisning av rask grønn innenfor hindbrai hulrom fra dorsal visning (Panel H). Både overflatisk og dyp injeksjoner resultat fra manglende evne til å oppfatte dybden på mikroinjeksjon pipetten etter at den kommer i kontakt med livmoren. En praktisk tilnærming som fungerer godt er å fremme pipetten gjennom livmoren og deretter umiddelbart pulsere gang å lete etter en puff av rask grønn: plasseringen av puff viser omtrentlig plassering av pipettespissen. Juster dybde basert på denne serien-funn puls.
Mangelfullt fabrikkert pipetter er den vanligste årsaken til mistargeting. Injeksjonen forsøket vist i paneler IK ble gjennomført med en pipette som ble manuelt brutt, men ikke skrå. Sideveis utsikt over E12.5 embryoet viser hindbrain (HB), venstre øye (e), og mikroinjeksjon pipetten (p). Merk at pipettespissen (pt) er kraftig bøyd og har unnlatt å trenge inn i livmoren (panel I). Anvendelse av ytterligere styrke skjærer spissen av pipetten (Panel J, pil), forlater pipavd. tips innebygd i livmoren. En liten mengde rask grønn (FG) ble kastet ut fra brukket pipetten og har fått øye på overflaten av livmoren. Den innebygde pipettespissen (Panel K) må fjernes med fine, steril tang og kastes som spissmel avfall. Hvis pipettespissen ikke kan lokaliseres eller fjernet, avlive dammen under narkose.
Dokumenter prosessuelle observasjoner på en mus overlevelse kirurgi databladet: Et avgjørende element for å lære disse metodene er å dokumentere observasjoner og foreta justeringer basert på disse observasjonene. Lag en mus overlevelse kirurgi datablad og merk preoperativ, operativ og postoperativ informasjon. Preoperativ data omfatter demning vekt, dose bedøvelse levert, plasmid injisert, etc. operative data omfatter embryo injiserte (dvs. R2 er den andre embryoet fra eggstokken i høyre livmor horn), kvaliteten på injeksjonsstedet (dvs. ingen Endolymphatic duct oppdaget, fargestoff i fire
Bruk gjeldende levert per puls for å optimalisere transfeksjon effektivitet: firkantbølge pulstog består av 5, 43volt og 50msec pulser med en 950msec interpuls forsinkelse. Den 5mm platina, padle stil elektroder sikre at hele otic territorium finnes innenfor det elektriske feltet. Lignende transfeksjon effektivitet kan oppnås med 3mm padleårer, selv om de er vanskeligere å nøyaktig posisjon. Pulsen paradigmet ble optimalisert ved å evaluere den nåværende overført til fosteret under den siste puls, ikke ved å feie gjennom spenninger og vurdere transfeksjon effektivitet. Begrunnelsen er at dagens levert per puls varierer ved konstant spenning avhengig patency av elektrisk kobling mellom livmoren og platina elektroder. Forutsatt at livmoren er friskt vannes med Ringer-laktat oppløsning rett før plassere padleårer og ladningsbærere er til stede i overkant, er politimesteren variable mengden av "kobling" trykket i livmoren med padleårer. Lett trykket på 43volts resulterer i <60mAmps av strøm levert og sporadiske transfeksjon på best. Moderat trykk på 43volts resultater i 60-100mAmps levert og den mest effektive transfeksjon. Sterkt press på 43volts resultater i> 100mAmps levert og korrelerer med vedvarende endret hjertefrekvens og økt embryonal dødelighet. Overdreven press sprekker den viscerale plommesekken (en "pop" kan oppleves gjennom padleårer) og forårsaker embryonal dødelighet. Det er sannsynlig at variabelen trykket endrer impedansen mellom elektrodene som påvirker dagens levert. Den pulsfrekvens på 1 Hz (en 50 millisekunder puls per sekund) ble definert som minst forstyrrende til embryoet hjertefunksjon syklus, som er en positiv korrelere for overlevelse av embryo. Vi konkluderer med at den mest avgjørende parameter å overvåke etablere en effektiv in vivo electroporation paradigme er det gjeldende levert per puls. Endring av enhver puls paradigme bør omfatte nøye overvåking av dagens levert per puls.
Adopter en modulær tilnærming til læring the teknikk: Modul 1: Øv en humbug kirurgi med livmor eksternalisering, men ikke injisere eller electroporate. Demninger tolerere ventrale laparotomi svært godt og bør aldri oppleve postsurgical komplikasjoner relatert til kirurgisk teknikk. Mus overlevelse kirurgiske ferdigheter er utvilsomt bosatt i hjemmet institusjonen så forfølge tilstrekkelig opplæring. Oppnå mestring av kirurgiske ferdigheter før du fortsetter. Modul 2: Praksis transuterine mikroinjeksjon i otocyst på en bedøvet dam uten forventning om å fullføre overlevelse kirurgi: avlive demningen under narkose, isolere injisert embryo, og vurdere kvaliteten på otocyst injeksjoner. Modul 3: Target kun to otocysts i 2 forskjellige embryoer med rask grønn, ikke electroporate, fullføre operasjonen, og validere nedstrøms overlevelse av embryo. Modul 4: Target kun to embryoer med DNA / rask grønn løsning, electroporate, validere nedstrøms overlevelse av embryo, og fastslå den transfeksjon efficiency. Modul 5: Target kun to embryoer med DNA / rask grønn løsning, electroporate, injisere Alexa Fluor i 4. ventrikkel til merke manipulerte fosteret, velger merket embryo ved P0, og fastslå den transfeksjon effektivitet.
Prosessuelle læringskurve: Mestring av musen overlevelse kirurgi teknikker, med riktig veiledning fra veterinær og kirurgisk stab av ens hjem institusjon, er ganske rask, og bør kun kreve 3-5 demninger-verd av praksis for nybegynnere å få kompetanse. Transuterine mikroinjeksjon og in vivo electroporation å generere nyttig transfekterte indre øret vil kreve 10-50 demninger-verdt innsatsen, antar det er 6 gjennomførbar embryoer per svangerskap og modulær tilnærming er fulgt. De elevene som liker aktiviteter som krever finmotorikk (dvs. spille et instrument, søm, modell-making, eller konkurrerende friidrett) har kortere opplæring perioder enn those som ikke gjør det. De kritiske korrelater for vellykket mestring av disse metodene er omhyggelige på detaljer (dvs. mikroinjeksjon pipette fabrikasjon, vaskulær anatomi, uttrykkelige notater) og en rimelig rolig oppførsel.
Arbeidsflyt: Når kompetanse er oppnådd, kan man forutse sprøytebruk og electroporating 4-6 embryoer per Dam; 3-5 embryoer vil overleve, og 2-4 embryoer vil ha fordel tilført indre ører for analyse. Den hindbrain Alexa Fluor merking teknikk til å merke embryoer for sortering ved fødselen krever ekstra hindbrain injeksjon i hver electroporated embryo, men dette er godt tolerert og ikke påvirke prosessuelle effektivitet. Dermed sammenligner utvinningsgraden av nyttig transfekterte indre ører fra in vivo electroporation positivt utvinningsgraden av homozygot mutant mus fra en heterogygous avl paradigme. Med erfaring, er 2-3 demninger per eksperimentator per dag en rimelig arbeidflyt: 1.5 timer per demning for kirurgi og totalt 1,5-2 timer for postoperativ overvåking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Humana Press om tillatelse til å publisere mikroinjeksjon pipetten fabrikasjon skikkelse som opprinnelig dukket opp på side 130 av referanse 11, Larry Dlugas og Steven Wong, OHSU Department of Educational Communications, for videography, Larry Dlugas for video design og redigering; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco for å designe våre egne horisontal laminær hette og Les Gullsmed for å gi teknisk skjematisk, Victor Monterroso, MV, MS, PhD og Tom Chatkupt, DVM, OHSU Institutt for komparativ medisin, for veiledning med vår dyr omsorg protokollen, kirurgiske teknikker, og profylaktisk analgesi regime, Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, for å dele sin handout på veterinærmedisinske suturing teknikker, Edward Porsov, MS, for å utforme vår Adobe Premiere Pro video mikroskopi datamaskin arbeidsstasjon, og Leah Hvit og jonas Hinckley av LNS Spesialtekst (Portland). Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institute on døvhet og other Communication Disorders: DC R01 008 595 og DC R01 008595-04S2 (til JB) og P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center kjerner Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
