En hurtig og effektiv metode til at integrere fremmed DNA af interesse i præfremstillede acceptor stammer, betegnet landingsplads stammer, er beskrevet. Fremgangsmåden tillader stedspecifik integration af et DNA-kassette i det konstruerede landingsplads locus af en given stamme, gennem konjugation og ekspression af det ΦC31 integrase.
Det bakterielle kromosom, kan anvendes til stabilt at opretholde fremmed DNA i mega-base mellem 1. Integration i kromosomet omgår emner såsom plasmidreplikation, plasmidstabilitet, plasmid uforenelighed, og antallet af plasmidkopier varians. Denne metode anvender den stedspecifikke integrase fra Streptomyces fagen (Φ) C31 2,3. Den ΦC31 integrase katalyserer en direkte rekombination mellem to specifikke DNA steder: attB og attP (34 og 39 bp, henholdsvis) 4. Denne rekombination er stabilt og ikke vende tilbage 5. En "landing pad" (LP) sekvensen bestående af en spectinomycin-resistens gen, Aada (SPR) og E. coli ß-glucuronidase-genet (uidA) flankeret af attP sites er blevet integreret i kromosomerne i Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi og Agrobacterium tumefaciens i en intergenisk region, ampC locus, og den tetA locus, hhv. S. meliloti anvendes i denne protokol. Mobiliserbar donor vektorer indeholdende attB-sites flankerer en stuffer rødt fluorescerende protein (RFP) gen og en antibiotisk resistens-gen er også blevet konstrueret. I dette eksempel gentamicin resistent plasmid pJH110 anvendes. RFP gen 6 kan erstattes med en ønsket konstruktion med Sph I og Pst I. Alternativt kan en syntetisk konstruktion flankeret af attB-sites kan være sub-klonet ind i en mobiliserbar vektor, såsom pK19mob 7. Ekspressionen af ΦC31 integrase-genet (klonet fra pHS62 8) drives af lac-promotoren på en mobiliserbar bredt værtsspektrum plasmid pRK7813 9.
En tetraparental parring protokol anvendes til at overføre donor kassetten i LP-stammen derved erstatte markører i LP-sekvensen med donor kassetten. Disse celler er trans-integranter. Trans-integranter er udformet med en typisk effektivitet på 0,5%. Trans-integranter er typisk inden for de første 500-1000 kolonier screenet ved antibiotisk følsomhed eller blå-hvid-screening ved anvendelse af 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucuronsyre (X-gluc). Denne protokol indeholder de parring og udvælgelse procedurer for at skabe og isolere trans-integranter.
Den IMCE teknik muliggør effektiv integration af en enkelt attB flankeres DNA'et kassetten i LP-locus af en tidligere udviklet stamme. Når den ønskede konstruktion klones i stedet for RFP at skabe donor kassetten, er teknikken ikke kræver efterfølgende DNA-oprensning og transformation, hvilket gør det meget robust. Det er vigtigt, at passende vækst kontroller er indbefattet, for at være sikker på antibiotikaresistens skyldes indførelsen af trans-integranter og ikke andre faktorer. <…
The authors have nothing to disclose.
For at Margaret CM Smith for venlig at give integrase klon
Økonomisk støtte fra:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery og strategiske projekt tilskud
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
SmUW227 strain | In house, available by request |