미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.
박테리아 염색체가 안정적으로 메가베이스 범위의 1에 외국의 DNA를 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 염색체에 통합은 플라스미드 복제, 플라스미드 안정성, 플라스미드 호환성 및 플라스미드 사본 번호 분산 등의 문제를 circumvents. 이 방법은 Streptomyces 파지 (Φ) C31 2,3에서 특정 사이트 integrase를 사용합니다. attB 및 attP (각각 34 39 BP) 4 : ΦC31 integrase 두 개의 특정 유전자 사이트 간의 직접적인 재조합을 catalyzes. 이러한 재조합은 안정하고 5 되돌릴 수 없습니다. spectinomycin – 저항 유전자, aadA (SpR), 그리고 E. 구성된 "방문 패드"(LP) 시퀀스 attP 사이트의 어귀 대장균 SS-glucuronidase 유전자가 (uidA) Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi 및 intergenic 지역의 Agrobacterium tumefaciens의의 염색체에 통합되었고, 오전각각 PC 현장, 그리고 tetA 현장. S. meliloti이 프로토콜에서 사용됩니다. stuffer 적색 형광 단백질 (RFP) 유전자와 항생제 내성 유전자 측면을 노릴 attB 사이트가있는 Mobilizable 기증자 벡터도 구축되었습니다. 이 예제에서는 gentamicin 내성 플라스미드 pJH110이 사용됩니다. RFP 유전자 6 SPH I 및 PST 나를 사용하여 원하는 구조로 대체될 수 있습니다 또는 attB 사이트의 어귀 합성 구조는 pK19mob 7과 mobilizable 벡터에 서브 복제있을 수 있습니다. ΦC31 integrase 유전자 (pHS62 8 일부터 복제)의 표현은 pRK7813 9 플라스미드 mobilizable 광범위한 호스트 범위에 LAC 프로 모터에 의해 구동됩니다.
tetraparental 짝짓기 프로토콜은 LP 변형이 됨으로써 기증자 카세트와 LP 시퀀스에서 마커를 교체로 기증자 카세트를 전송하는 데 사용됩니다. 이러한 세포는 트란입니다S-integrants. 횡단 integrants은 0.5 %의 전형적인 효율을 형성하고 있습니다. 횡단 integrants는 일반적으로 5 – 브로모 -4 – 클로로 -3 – 인돌릴 – 베타-D-glucuronic 이상해진 (X-gluc)을 사용하여 항생제 감수성이나 청색 – 흰색 심사에 의해 상영 첫 500-1,000 식민지 내에 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 횡단 integrants를 생성하고 분리를위한 짝짓기 및 선정 절차가 포함되어 있습니다.
IMCE 기술은 이전에 설계 변형율의 LP-현장으로 단일 attB 어귀의 DNA 카세트의 효율적인 통합을 허용합니다. 원하는 구조가 기증자 카세트를 만드는 RFP 자리에 복제되면 기술은 매우 강력하고, 이후 DNA를 정제 및 변환을 필요로하지 않습니다. 그것은 항생제 저항이 횡단 integrants 및 기타 아니라 요소의 생성에 의한 특정 말하면, 적절한 성장 컨트롤이 포함되어있는 것이 중요합니다.
…The authors have nothing to disclose.
친절 integrase의 클론을 제공하는 마가렛 CM 스미스에게
부터 지원 자금 :
게놈 캐나다 / 게놈 프레리
NSERC 발견과 전략적 사업 보조금
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
SmUW227 strain | In house, available by request |