Это видео демонстрирует протокол новый метод генерации и последующей очистки нейронных клеток-предшественников из возобновляемых источников нервные стволовые клетки (НСК) на основе их физических (размер и внутренней детализации) и флуоресцентные свойства с помощью технологии проточной цитометрии.
Нервные стволовые клетки (НСК) могут быть выделены и расширен в больших масштабах, используя neurosphere анализа и дифференцированы на три основных типа клеток центральной нервной системы (ЦНС), а именно астроциты, олигодендроциты и нейроны. Эти характеристики делают нейронных стволовых и прогениторных клеток бесценный возобновляемый источник клеток для лабораторного исследования, такие как наркотики, Нейротоксикология и электрофизиологии, а также для мобильных заместительной терапии при многих неврологических заболеваний. На практике, однако, неоднородность НСК потомство, низкое производство нейронов и олигодендроцитов и астроцитов преобладание после дифференциации ограничить их клинического применения. Здесь мы описываем новую методологию для создания и последующей очистки незрелых нейронов с мышиным потомством НСК активировать с помощью флуоресцентной сортировки клеток (FACS) технологии. Используя эту методологию, обогащенного нейронные популяции клеток-предшественников может быть достигнут умомHout заметного астроцитов и добросовестных загрязнения НСК. Процедура включает в себя дифференциацию НСК потомство изолированы и расширен с E14 мыши ганглиозные возвышения использованием neurosphere анализа, с последующим выделением и обогащение незрелых нервных клеток в зависимости от их физических (размер и внутреннюю сложность) и флуоресцентные свойства с помощью технологии проточной цитометрии. В целом, это занимает 5-7 дней для получения нейросферы и 6-8 дней, чтобы дифференцировать НСК потомство и изоляции высокоочищенных незрелых нервных клеток.
Возможность изолировать определенный нейронных клеточных популяций (например, нейроны, астроциты и олигодендроциты) может решить некоторые из препятствий, связанных с клиническим применением нервные стволовые клетки (НСК). Во-первых, она позволяет нам в полной мере характеризуют нач?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана финансирование от Фонда Overstreet.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.