Analytiska tekniker för analys av kväveoxid Bioaktivitet
Summary
Den endogena produktionen av kväveoxid (NO) reglerar ett stort antal olika biologiska funktioner. Det blir allt tydligare att störningar eller dysreglering av NO baserad signalering är involverad i många mänskliga sjukdomar. Metoder för att kvantifiera relevanta inga metaboliter kan ge nya diagnostiska eller prognostiska biomarkörer för sjukdomar hos människor.
Abstract
Kväveoxid (NO) är en diatomär fria radikaler som är mycket kortlivad i biologiska system (mindre än 1 sekund i cirkulerande blod) 1. NO kan vara en av de mest viktiga signalmolekyler som produceras i kroppen, som reglerar viktiga funktioner inkluderande men ej begränsade till reglering av blodtryck, immunsvar och neurala kommunikation. Därför sin noggrann detektion och kvantifiering biologiska matriser är avgörande för att förstå betydelsen av NO i hälsa och sjukdom. Med en sådan kort fysiologisk halveringstid av NO, har alternativa strategier för påvisande av reaktionsprodukter av NO biokemi utvecklats. Kvantifiering av relevanta inga metaboliter i flera biologiska fack ger värdefull information när det gäller in vivo NO-produktion, biotillgänglighet och metabolism. Helt enkelt provtagning samma utrymme såsom blod eller plasma inte alltid en korrekt bedömning av hela body NO status, särskilt i vävnader. Förmågan att jämföra blod med utvalda vävnader i försöksdjur kommer att bidra till att överbrygga klyftan mellan grundforskning och klinisk medicin när det gäller diagnostisk och prognostisk nyttan av NO biomarkörer i hälsa och sjukdom. Därför är extrapolering av plasma eller blod NR status till specifika vävnader av intresse inte längre en giltig metod. Som ett resultat, metoder fortsätta att utvecklas och valideras som tillåter detektion och kvantifiering av NO och NO-relaterade produkter och metaboliter i flera fack av försöksdjur i vivo. Den etablerade paradigm av NO biokemi från produktion av NO-syntaser till aktivering av lösligt guanylylcyklas (SGC) för att eventuellt oxidation till nitrit (NO 2 -) och nitrat (NO 3 -) får endast utgör en del av NO effekter in vivo. Interaktionen av NO och NO-härledda metaboliter med proteintioler, sekundära aminer, och metaller för att bilda S-nitrosothiOLS (RSNOs), N-nitrosaminer (rnNOS) och nitrosyl-hem representerar respektive cGMP-oberoende effekter av NO och sannolikt lika viktigt fysiologiskt som aktivering av SGC av NO. En verklig förståelse av NO i fysiologi härrör från in vivo-experiment provtagning flera fack samtidigt. Kväveoxid (NO) metod är en komplex och ofta förvirrande vetenskap och fokus för många debatter och diskussioner om NO biokemi. Klarlägga nya mekanismer och signalvägar som inte innebär några hänger på vår förmåga att specifikt, selektivt och varsamt upptäcka och kvantifiera NO och alla relevanta NO produkter och metaboliter i komplexa biologiska matriser. Här presenterar vi en metod för snabb och känslig analys av nitrit och nitrat med hjälp av HPLC samt detektering av fri NO i biologiska prover med hjälp av in vitro ozon baserad kemiluminiscens med kemiska derivitazation att bestämma molekylära källa NO samt ex vivo medOrganbadet myography.
Protocol
Discussion
De metoder som beskrivs här för kvantifiering av relevanta inga metaboliter i flera biologiska fack kommer att möjliggöra fingeravtryck av NO biologi i hälsa och sjukdom som kan korreleras med funktionella mätningar av NO från endotelet. Dessa metoder kräver enkel provberedning med potential för anpassning för hög genomströmning. Den relativa mängden av dessa molekyler kan hjälpa till att förstå produktionen av NO och dess metaboliska öde i ett antal experimentella modeller av sjukdomen och även seriel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Hong Jiang, Ph.D. och Deepa Parathasarthy, MPH, BDS för tekniskt stöd.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| N-ethylmaleimide | Thermo Scientific | 23030 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 |
| Autosampler | Alcott | |
| DMT Myograph | AD Instruments | |
| PowerLab | AD Instruments | |
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
References
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
- Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
- Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
- Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
- Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
- Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
