Summary

Quantificazione di colonizzazione fungina, sporogenesi, e la produzione di micotossine Uso Bioassays Kernel

Published: April 23, 2012
doi:

Summary

La devastazione delle colture di cereali da semi-infezione funghi ha spinto numerosi sforzi di ricerca per comprendere meglio le interazioni pianta-patogeno. Per studiare le interazioni semi-fungine in un ambiente di laboratorio, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per la quantificazione della riproduzione fungina, la biomassa, e la contaminazione da micotossine mediante biotest del kernel.

Abstract

La putrefazione di cereali da seme-infettanti funghi rappresenta una delle più grandi sfide economiche a livello mondiale di produzione di cereali, per non parlare di gravi rischi per la salute umana e animale. Tra la produzione di cereali, il mais è probabilmente la coltura più colpita, a causa di agenti patogeni indotte perdite di integrità del grano e di semi di contaminazione da micotossine. I due micotossine più diffuse e problematiche per i coltivatori di mais e degli alimenti e dei mangimi sono processori aflatossina e fumonisina, prodotta da Aspergillus flavus e Fusarium verticillioides, rispettivamente.

Recenti studi molecolari delle interazioni pianta-patogeno hanno dimostrato promessa la comprensione dei meccanismi specifici associati con le risposte delle piante alle infezioni fungine e contaminazione da micotossine 1,2,3,4,5,6. Poiché molti laboratori utilizzando saggi kernel per studiare le interazioni pianta-patogeno, vi è la necessità di un metodo standard per quantificare diversi parametri biologici, cosìrisultati dei diversi laboratori possono essere cross-interpretato. Per un mezzo robusto e riproducibili per le analisi quantitative sui semi, abbiamo sviluppato in laboratorio e metodi di test del kernel successivi per quantificare la crescita di funghi, biomasse e contaminazione da micotossine. Quattro chicchi di mais sterilizzati vengono inoculati in fiale di vetro con una sospensione fungina (10 6) e incubati per un periodo predeterminato. Vial vengono scelti per il conteggio di conidi mediante analisi biomassa emocitometro, ergosterolo basato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), quantificazione aflatossine utilizzando un metodo AflaTest fluorometro, e quantificazione fumonisina mediante HPLC.

Protocol

1. Kernel Bioassay mais Due settimane prima, la cultura dei patogeni fungini, in agar patata destrosio (PDA) a 28 ° C. Selezionare kernel con dimensioni e forma simili, preferibilmente appiattito in modo che giaceva a livello con la parte inferiore di fiale bioassay, e il luogo in provette da 50 ml Falcon. Kernel selezionati devono essere stati prodotti in concomitanza stesso ambiente per garantire età simile seme e la composizione metabolita. Superficie sterilizzare kernel agitando prov…

Discussion

<p class="jove_content"> I metodi descritti qui sono stati ampiamente testati e di comprovata robustezza nella generazione di risultati quantificabili per la colonizzazione fungina, sporogenesi, e la produzione di micotossine. Inoltre, questi metodi dovrebbe essere applicabile a semi di altre specie di piante che sono sensibili alla contaminazione da funghi micotossigeni (es. arachidi, grano, cotone, pistacchi, ecc.) Per competenti pianta-patogeno analisi di interazione, è imperativo che i semi essere mantenuto in vita. Un sito piccola feri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Brandon Hassett e Carlos Ortiz per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal contributi NSF IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS-0925561 e al Dr. Michael Kolomiets, e dalla USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), la selezione vegetale AFRI e borsa di studio # 2010-85117 -20.539 a Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit e Kolomiets Michael.

Materials

Name of the reagent Company Catalog #
Potato Dextrose Agar Fisher Scientifc S71659A
Tween-20 Fisher Scientifc BP337-100
Plastic incubation container Sterilite 1713LAB06
Blender Vicam 20200
24 cm Fluted Filter Papers Vicam 31240
1.5 μm glass microfibre Vicam 31955
Afla Test column Vicam G1024
Afrla Test Developer Vicam 32010
Methanol Vicam 35016
Acetonitrile Fisher Scientifc AC14952-0025
Ethanol Fisher Scientifc AC39769-0025
C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) Fisher Scientifc 60108-304
O-phthalaldehyde (OPA) Sigma Chemical Co 79760-5g
Boric acid Fisher Scientifc BP168-500
Sodium borate Fisher Scientifc RDCS0330500
Mercaptoethanol Fisher Scientifc 45-000-231
Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) Shimadzu Scientific Instruments, Inc. LC-20AT
Zorbax ODS column (4.6x150mm) Agilent Technologies 443905-902
Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector Shimadzu Scientific Instruments, Inc. RF-10AXL
Sodium phosphate Fisher Scientifc AC38987-0010
FB1 standards Sigma Chemical Co. F1147-1mg
Chloroform VWR MK444410
13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) Pall Life Science 4426
Ergosterol Sigma-Aldrich 45480-50G-F
Scintillation vials VWR 66021-602
Sodium Chloride Vicam G1124

References

  1. Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
  2. Gao, X., Shim, W. -. B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
  3. Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus – seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
  4. Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
  5. Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
  6. Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
  7. Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
  8. Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
  9. Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
  10. Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
  11. Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
  12. Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
  13. Christensen, S. A. . Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
  14. Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
  15. Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).

Play Video

Cite This Article
Christensen, S., Borrego, E., Shim, W., Isakeit, T., Kolomiets, M. Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays. J. Vis. Exp. (62), e3727, doi:10.3791/3727 (2012).

View Video