Summary
A devastação das culturas de cereais por fungos que infectam sementes de suscitou numerosos esforços de pesquisa para entender melhor planta-patógeno interações. Para estudar sementes de fungos interações em um ambiente de laboratório, nós desenvolvemos um método robusto para a quantificação de reprodução dos fungos, biomassa e contaminação por micotoxinas utilizando bioensaios de kernel.
Abstract
O apodrecimento de grãos por semente de fungos que infectam representa um dos maiores desafios econômicos à produção mundial de cereais, para não mencionar os riscos graves para a saúde humana e animal. Entre a produção de cereais, o milho é sem dúvida a cultura mais afetada, devido ao patógeno induzidas por perdas na integridade de grãos e sementes de contaminação por micotoxinas. As duas micotoxinas mais prevalentes e problemático para os produtores de milho e alimentos e processadores de alimentos são aflatoxina e fumonisina, produzida por Aspergillus flavus e Fusarium verticillioides, respectivamente.
Recentes estudos moleculares em planta-patógeno interações têm demonstrado promessa em compreender os mecanismos específicos associados com a resposta das plantas à infecção por fungos e contaminação por micotoxinas 1,2,3,4,5,6. Porque muitos laboratórios são usando ensaios de kernel para estudar organismos patogénicos de plantas interacções, não há uma necessidade de um método padronizado para quantificar diferentes parâmetros biológicos, de modoresultados de diferentes laboratórios podem ser cross-interpretado. Para um meio robusto e reprodutível para análises quantitativas de sementes, temos desenvolvido ensaios em laboratório e os métodos do kernel posteriores a quantificar o crescimento de fungos, biomassa e contaminação com micotoxinas. Quatro grãos de milho esterilizados são inoculadas em frascos de vidro com a suspensão fúngica (10 6) e incubadas durante um período predeterminado. Frascos de amostra são então seleccionados para a enumeração de conídios por análise de biomassa hemocitómetro, ergosterol baseada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a quantificação aflatoxina utilizando um método AflaTest fluorómetro, e quantificação de fumonisina por HPLC.
Protocol
1. Bioensaio Kernel milho
- Duas semanas antes da cultura, os fungos patogénicos em Agar de Batata Dextrose (PDA) a 28 ° C.
- Seleccione grãos com tamanho e forma semelhantes, de preferência achatada assim que colocam em nível com a parte inferior de frascos de bioensaio, e colocar em tubos de 50 ml Falcon. Kernels seleccionados devem ter sido produzidos simultaneamente em mesmo ambiente para garantir a idade de sementes semelhante e composição metabolito.
- Tona esterilizar miolo por agitação tubos à temperatura ambiente durante 5 minutos com etanol a 70%, 1 minuto com água estéril, e 10 minutos com hipoclorito de sódio a 6%. Lavar, três vezes, durante 5 minutos de cada vez, com água estéril, agitando contínua. Kernels Secar em toalhas autoclavados.
- Para facilitar a infecção de Aspergillus flavus, criar uma pequena ferida no embrião lado com uma agulha 18 G até à profundidade de 0,5 cm. No entanto, em nossa experiência maior ferida é necessário para a infecção Fusarium verticillioides. Therefore, utilizar uma lâmina de barbear para cortar no embrião lado-a uma profundidade de 0,5 mm.
- Preparar suspensão do inóculo por raspagem placas de cultura em cerca de 5 ml de solução autoclavada 0,01% de Tween-20 para libertar os esporos e remover o micélio por filtração através de gravidade, pelo menos, 4 camadas de gaze esterilizada. Calcular a concentração de esporos com hemocitômetro e ajuste para 10 6 esporos / mL para A. flavus ou F. verticillioides. Se usando outras espécies de patógeno ou hospedeiro, é importante avaliar as concentrações de inoculo para a infecção apropriado.
- Criar uma câmara de humidade num recipiente de plástico (29,2 cm X 18,7 cm X 8,3 cm) revestidas com cinco folhas de toalhas de papel e 100 ml de água estéril. Câmara não é a água ou ar apertado e água deve ser adicionado ao longo experimento para manter toalhas de papel úmido.
- Coloque quatro núcleos em um frasco de 20 ml autoclavado cintilação de vidro e registrar sua massa. Inocular com 200 uL suspensão de esporos,boné e vortex para kernels uniformente com suspensão. Solte as tampas para permitir livremente a troca de ar e colocar em câmara de umidade.
Nota: Para sementes ou outros fungos que os descritos nestes métodos, a quantidade de inoculo necessária pode ser diferente e pode ser derivada experimentalmente.
- Incubar grãos sob um fotoperíodo 12-h-light/12-h-dark a 28 ° C durante 7 dias ou até desejado.
2. Enumeração conídios
- Após o período de infecção, adicionar 5 ml de autoclavado 0,01% de Tween-20 para frascos de cintilação contendo grãos infectados e Vortex cuidadosamente durante 1 minuto.
- Usando uma pipeta de ponta larga furo, imediatamente diluir pela transferência de duas separadas alíquotas de 200 ul de suspensão de esporos em tubos Eppendorf contendo 2,0 ml 1,8 ml de 0,01% de Tween-20 (ou diluir conforme necessário, dependendo da infecção).
- Enumerar cada alíquota de 200 uL por duas vezes com um hemocitómetro 4e comparar os níveis de conídios entre os tratamentos.
3. Quantificação de aflatoxina
- Adicionar núcleos a partir de uma amostra de 50 ml misturador copo com 20 ml de metanol a 80% e 0,05 g de NaCl, a tampa e da mistura a alta velocidade durante 1 min.
- Coloque um papel de filtro de pregas ao longo de um recipiente de coleta limpo e despeje o extrato em filtro.
- Transferem-se 10 ml do filtrado para um recipiente limpo, adicionar 20 ml de H2O destilada, e misturar bem.
- Amostra de filtro através de um filtro de microfibra 1,5 mM de vidro em um copo limpo.
- Aplicar 1 ml de extracto filtrado para Afla coluna de teste e, utilizando ar comprimido, forçar o extracto filtrado através da coluna a uma taxa de 1-2 gotas por segundo até esvaziadas.
- Lavar a coluna duas vezes com 1 ml de H2O destilada e passar através da coluna a 1-2 gota / segundo até que o ar passa.
- Coluna eluir com 1 ml de metanol a 100% HPLC numa 1-2 gota / segundo taxa recolhido numa cuvete de vidro.
- Adicionar1 ml de Afla Desenvolvedor de teste para eluato e misture bem. Cuvete lugar em fluorómetro calibrado e lida a 60 seg.
Nota: Quando se utiliza o protocolo Aflatest FGIS, a medição a partir do fluorómetro é calculada com base um período inicial de 50 gramas de amostra extraída em 100 ml. Se se considera a diluição da amostra com a água, o 1 ml aplicado a uma coluna representa 0,166 gramas de amostra. Assim, ao modificar o protocolo, você precisa levar em conta as diferenças de tamanho da amostra e da solução de extração inicial. Por exemplo, 2 gramas de grãos são extraídos em 20 ml de metanol 80%. Este é de 0,1 gramas / ml. Quando 1 ml desta amostra é misturada com 2 ml de água, a proporção de amostra no líquido é agora 0,033 gramas / ml. Se esta amostra dá uma leitura fluorómetro de 100 ppb, a concentração real baseia-se na proporção de amostra para 0,166, isto é, ppb = (0,166 grama X 100 ppb) / 0,1 grama), ou 166 ppb. Para quantificação de aflatoxina alternativamétodos de cátions, ver referência 7.
4. Fumonisina B1 (FB1) Análise
- Quando fungo é cultivado em grãos de milho, extrair amostras durante a noite com 10 ml de acetonitrilo / água (50/50, v / v) à temperatura ambiente sem agitação. Subsequentemente, misturar o extracto (2 ml) com água desionizada (6 ml), e aplicar esta mistura (8 ml) directamente para a extracção de fase sólida C-18.
- Antes de carregar amostra pré-condição, a coluna de extracção C-18 de fase sólida, por lavagem com 2 ml de acetonitrilo seguido por 2 ml de água.
- Após o carregamento da amostra, a coluna é lavada com 2 ml de água seguido por 2 ml de acetonitrilo / água (15/85, v / v). Amostra para análise por HPLC (contendo FB1) é eluída com 2 ml de acetonitrilo / água (70/30, v / v).
- Derivatizar FB1 com o-phthaldehyde (OPA) por transferência de 0,1 ml do eluato da coluna para um frasco contendo 0,1 ml de tampão de borato (0,05 M bórico acid/0.05 de sódio M de borato [50/50, v / v] pH, 8,5) e 0,1 OPA ml (0,1 mg / ml em acetonaitrile com 0,5% - mercaptoetanol).
- Parar a reacção após 10 min por adição de 0,5 ml de acetonitrile/0.01 M de ácido bórico (40/60, v / v).
- Analise FB1 numa HPLC Shimadzu LC-20AT sistema equipado com uma coluna analítica ODS Zorbax (4,6 mm 150) e um comprimento de onda variável Shimatzu detector RF-10Axl de fluorescência (excitação 335 nm / emissão 440 nm).
- Um gradiente linear é usada (solvente A: acetonitrile/0.1 M fosfato de sódio (40/60), pH 3,3, solvente B: acetonitrilo / fosfato de sódio 0,1 M (60/40), pH 3,3) eo programa de gradiente é como se segue: 100% de A. a 100% de B em 10 min B, 100% durante 5 min
- Analise FB1 padrões por HPLC, e medição da área de pico são utilizados para gerar a curva padrão. Subsequentemente, quantificar FB1 nível de uma amostra por comparação com as áreas dos picos FB1 curva padrão.
5. Ergosterol Análise
- Cultura do fungo em grãos de milho por 7-14 dias.
- Após o período de incubação, adicionam-se 10 ml de clorofórmio: metanol (2:1, v / v) em cada frasco. Uma vez adicionado, agitar amostras bem e depois incubar frascos no escuro à temperatura ambiente durante 24 horas.
- Após 24 hrs, centrifugar as amostras, e recolher o sobrenadante e filtrar através de membrana de nylon 0,45 um.
- Injectar a amostra directamente para um sistema de HPLC Shimadzu LC-20AT equipado com um 4,6 U coluna ODS-C18 (200 A, 250 ± 4,6 mm) e um Shimadzu UV SPD-20A / detector VIS definido para monitorar a 282 nm.
- Use metanol (100%) a um caudal de 1,5 mL / min como a fase móvel. Determinar a quantificação de ergosterol em amostras por comparação das áreas de pico de amostras com uma curva padrão gerada a partir de HPLC ergosterol.
6. Os resultados representativos
Após a inoculação e incubação numa câmara de humidade durante dois a três dias, o crescimento de fungos deve começar a aparecer sobre os núcleos. Sete dias após o tratamento, o crescimento vegetativo das plantas tratadas devem ser claramente visíveis, whilcontrolos electrónicos simulados deve ser não infectados (Figura 1B, no topo). Os períodos de incubação mais longo são favoráveis a mais abundante crescimento vegetativo (Figura 1B, inferior). Sob as condições aqui descritas (Figura 2G), A. flavus de tipo selvagem NRRL 3357 indicadas valores máximos de colonização, a acumulação de aflatoxina, e produção de conídios de 8, 6, e 8 dias, respectivamente (Figura 2, CA). No entanto, quando a contaminação com micotoxinas e conidiação foram comparados por unidade de ergosterol, os maiores níveis foram observados 4 e 6 dias, respectivamente (Figura 2, DE). Figura 2F resume estes fungos biomassa-dependentes valor máximo-observações. Curiosamente, entre 4-6 dias após a inoculação, os grãos sofrem degradação de ácido nucleico, como visto pelo RNA total a partir de amostras sobre o tempo de curso-(Figura 2H, parte inferior).
Vários estudos, incluindo a nossa, têm exaed F. verticilliodies infecção em grãos de milho 2,8,9,10,11,12 e utilizado com sucesso 7-13 dias como tempo-pontos para as observações. Utilizando os métodos aqui descritos, fumonisina níveis variam de 3,500-8,000 ng / g gama núcleo 4,13 e os níveis de ergosterol de 5.000-10.000 ng / g núcleo 14,13. Figura 3 mostra picos representativos para fumonisina (superior) e ergosterol (inferior ) de HPLC cromatogramas. Medição do ergosterol também pode ser realizada através de espectros de absorvância 15.
Figura 1. Fluxograma para a quantificação da biomassa fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas e os resultados representativos para o crescimento vegetativo de bioensaios de núcleo. A) Fluxograma delineando o método descrito para a quantificação de parâmetros biológicos fundamentais utilizados para avaliar patogénese do fungo sobre grãos de milho. B) Representanteresultados para bioensaios de kernel. Top, A. flavus (NRRL3357) crescimento vegetativo em grãos de milho no fundo B73 genética. As sementes foram inoculadas com 200 ul de 10 6 esporos / mL e fotografias foram tiradas 7 dias após a inoculação. Inferior, F. verticillioides inoculados em grãos B73 fundo de 13 dias após a infecção. Grãos foram inoculados com 200 ul de 10 6 esporos / mL.
Figura 2. Aspergillus flavus bioensaio kernel do tempo do curso. B73 núcleos foram inoculados com 200 ul de 10 6 esporos / ml de suspensão de Aspergillus flavus conídios e incubadas durante 2-8 dias (G). Todos os valores foram determinados a partir da média de peso seco de 4 grãos (n = 3-4; média ± SE). A) A colonização (com base no ergosterol), (B) aflatoxina, e (C) conidiação foram quantificados utilizando métodos descritos acima. E) A aflatoxina e (F) conidiação são exibidascomo uma função da biomassa fúngica como medido através h ergosterol. F) os valores máximos de ergosterol, a acumulação de aflatoxina, e conidiação como uma função da biomassa fúngica - valores máximos para cada quantidade observada foi definido como 100%. (H) 1 ug por pista de RNA total de tempo-curso.
Figura 3. Representativos Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) cromatogramas de fumonisina B1 (topo) e ergosterol (inferior) isolado a partir de grãos infectados com Fusarium verticillioides (M3125).
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Discussion
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Brandon Hassett e Carlos Ortiz por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela NSF subsídios IOB-0544428, 0951272-IOS e IOS-0925561 com o Dr. Michael Kolomiets, e pelo USDA Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (Nifa), Melhoramento de Plantas DRFA e Grant Educação # 2010-85117 -20539 para os drs. Seth Murray, Thomas Isakeit e Kolomiets Michael.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientific | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Blender | Vicam | 20200 | |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 | |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 | |
| Afla Test column | Vicam | G1024 | |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 | |
| Methanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | AC14952-0025 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC39769-0025 | |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientific | 60108-304 | |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma-Aldrich | 79760-5g | |
| Boric acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Sodium borate | Fisher Scientific | RDCS0330500 | |
| Mercapt–thanol | Fisher Scientific | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Corporation | LC-20AT | |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Corporation | RF-10AXL | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | AC38987-0010 | |
| FB1 standards | Sigma-Aldrich | F1147-1mg | |
| Chloroform | VWR international | MK444410 | |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Corporation | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Scintillation vials | VWR international | 66021-602 | |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -H., Shim, W. -B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
