Summary
종자 - 감염 곰팡이에 의한 시리얼 작물의 참화 더 나은 식물 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 많은 연구 노력을하라는 메시지가있다. 실험실 환경에서 씨앗 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 곰팡이 복제, 바이오 매스, 그리고 커널 bioassays를 사용하여 진균 독소 오염의 부량위한 강력한 방법을 개발했다.
Abstract
에 의해 입자의 썩어가는 씨앗 - 감염 곰팡이는 인간과 동물 건강에 심각한 위험을 언급하지 않기로, 시리얼 생산 세계적으로 가장 큰 경제적 어려움 중 하나가 포즈. 시리얼 생산 중에서 옥수수는 곡물 무결성 및 진균 독소의 종자 오염의 병원체 유발 손실로 인해 거의 틀림없이 가장 영향을받는 작물이다. 옥수수 재배자 및 식품 및 사료 프로세서를위한 두 가지 가장 널리 사용하고 문제가 mycotoxins는 각각 Aspergillus flavus와 Fusarium의 verticillioides 제작한 아플라톡신과 fumonisin, 수 있습니다.
분자 식물 - 병원균 상호 작용의 최근 연구에 곰팡이 감염 및 진균 독소 오염 1,2,3,4,5,6으로 식물 반응과 관련된 구체적인 메커니즘을 이해 약속을 증명하고있다. 많은 실험실이 식물 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 커널 assays를 사용하고 있기 때문에, 서로 다른 생물 학적 매개 변수를 quantifying위한 표준화된 방법에 필요하므로,이다른 실험실에서 결과를 비교 해석될 수 있습니다. 씨앗에 대한 정량 분석을위한 강력하고 재현할 수단을 위해서는 곰팡이 성장, 바이오 매스 및 진균 독소 오염을 수치 인 - 실험실 커널 assays와 후속 방법을 개발했습니다. 네 소독 옥수수 커널은 곰팡이 서스펜션 (10 6)와 함께 유리 튜브 안에 주사하고 미리 정해진 기간 동안 incubated됩니다. 샘플 튜브 그러면 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC), AflaTest fluorometer 방법을 사용하여 아플라톡신의 부량, 그리고 HPLC에 의한 fumonisin의 부량하여 hemocytometer, ergosterol 기반의 바이오 매스 분석하여 conidia의 열거를 위해 선택됩니다.
Protocol
1. 옥수수 커널 Bioassay
- 두 주 전에, 문화 28의 감자 덱스 트로 오스 한천 배지 (PDA)에서 곰팡이 병원균 ° C.
- 그들이 bioassay의 튜브의 바닥과 수준, 50 ML 팔콘 튜브의 위치를 누워 있도록 선호 평평 비슷한 크기와 모양으로 커널을 선택합니다. 선택된 커널은 유사한 종자 연령 및 신진 대사 조성을 위해 동일한 환경에서 동시에 생산된 것이어야합니다.
- 6 % 나트륨 차아 염소 산염과 70 % 에탄올, 멸균 물 1 분, 10 분 : 5 분 동안 실온에서 튜브를 흔들어하여 커널을 소독 표면 이군. 계속 떨고 동안 멸균 물을 때마다 5 분, 세 번 씻어. autoclaved 수건에 건조한 팻 커널.
- Aspergillus flavus의 감염을 촉진하기 위해서, 0.5 cm의 깊이에 18 G 바늘로 배아 사이드에 작은 상처를 만듭니다. 그러나 우리의 경험에 큰 상처가 Fusarium의 verticillioides 감염 필요합니다. 일erefore, 0.5 mm의 깊이에서 배아 사이드로 잘라 면도날을 사용합니다.
- 포자를 해방하고 autoclaved 일종의 투박한 무명의 최소 4 레이어를 통해 필터링 중력에 균사체를 제거하는 autoclaved 0.01 % 십대 초반-20 솔루션의 약 5 ML에 교양 번호판을 위해서 힘든하여 inoculum 서스펜션을 준비합니다. hemocytometer로 포자 농도를 계산하고 10 6 포자 / A 용 ML 조정 flavus 또는 F. verticillioides. 다른 종의 병원균이나 호스트를 사용하는 경우, 적절한 감염 inoculum의 농도를 평가하는 것이 중요합니다.
- 종이 타올 다섯 시트 및 멸균 물 100 ML 줄지어 플라스틱 컨테이너 (29.2 cm X 18.7 cm X 8.3 ㎝)의 습도 챔버를 만듭니다. 상공 회의소가 아닌 물 또는 공기 꽉 및 추가 물은 종이 타올은 습기가 유지하는 실험을하는 동안 추가되어야합니다.
- 장소 네 autoclaved 20 ML 유리 섬광 유리병에 커널과 그 질량을 기록합니다. 200 μl 포자 현탁액과 예방모자 및 정지로 고르게 코트 커널에 소용돌이. 자유롭게 습도 챔버로 공기 교환 및 장소를 허용하도록 뚜껑을 풀어.
주 : 씨앗 또는 이러한 방법에서 설명한 이외의 진균류의 경우 inoculum 필수의 금액이 다를 수 있으며 실험적으로 도출되어야한다.
- ° C에서 7 일간이나 28이나 원하는까지 12-h-light/12-h-dark photoperiod 미만의 커널을 품어.
2. Conidia의 열거
- 감염 기간 후 1 분 철저하게 감염된 커널과 소용돌이를 포함하는 섬광 튜브에 autoclaved 0.01 % 십대 초반-20의 5 ML에 추가합니다.
- 넓은 구멍 피펫 팁 사용하면, 즉시 0.01 % 십대 초반-20 (또는 감염에 따라 필요에 따라 희석)의 1.8 ML을 포함하는 2.0 ML Eppendorf 튜브에 포자 현탁액의 두 개의 서로 다른 200 μl aliquots를 전송하여 희석.
- hemocytometer 4 회 각 200 μl 나누어지는을 열거그리고 트리 트먼트 사이 conidia의 수준을 비교합니다.
3. 아플라톡신의 부량
- 80 % 메탄올 및 0.05 g NaCl, 1 분 고속으로 표지 및 조화 20 ML : 1 개 시료 50 ML 믹서 컵에 커널을 추가합니다.
- 깨끗한 수거 용기를 통해 홈 붙이 필터 용지를 삽입하고 필터로 추출을 붓는다.
- 깨끗한 그릇에 여과액 10 ML 전송 20 ML 증류수 H 2 O를 추가하고 잘 섞는다.
- 깨끗한 컵에 1.5 μm의 유리 microfibre 필터를 통해 필터 샘플.
- Afla 테스트 열에 필터링된 추출물의 1 ML을 적용하고, 압축 공기를 사용하는 비운까지 1-2 드랍스 / 초의 속도로 칼럼을 통해 여과 추출물을 강제.
- 증류수 H 2 O 1 ML에 두 번 칼럼을 씻어 놓기 / 초 공기를 넘지 때까지 1-2에서 컬럼을 통과.
- 드롭 / 유리 cuvette에 수집된 초 속도 1-2에서 1ml 100 % HPLC 급 메탄올과 Elute 칼럼.
- 추가한 eluate로 Afla 시험 개발자의 ML과 잘 섞는다. 장소 보정 fluorometer로 cuvette 60 초에서 읽어보세요.
참고 : Aflatest FGIS 프로토콜을 사용하는 경우 fluorometer의 측정 100 ML에서 추출한 시료의 초기 50g를 기반으로 계산됩니다. 네가 물과 시료의 희석을 고려하면 한 ML이 샘플의 0.166 g을 나타냅니다 칼럼에 적용. 그래서 프로토콜을 수정할 때, 당신은 계정으로 표본의 크기의 차이와 초기 추출 솔루션을해야합니다. 예를 들어, 커널 2g 20 ML 80 % 메탄올로 추출됩니다. 이것은 0.1 g / ML입니다. 이 샘플 1 ML은 2 ML 워터와 혼합되면 액체의 시료의 비중은 이제 0.033 g / ML입니다. 이 샘플은 100 ppb의 fluorometer 읽기를 제공하는 경우 실제 농도는 ppb = (0.166 g X 100 ppb) / 0.1 g), 또는 166 ppb는 0.166으로 시료의 비중에 따라 달라집니다. 대안 아플라톡신 quantifi위한양이온 방법, 참고 7 참조하십시오.
4. Fumonisin B1 (FB1) 분석
- 곰팡이가 옥수수 커널에서 재배되면 교반하지 않고 상온에서 acetonitrile / 물 (50분의 50, V / V)의 10 ML과 하룻밤 샘플을 추출합니다. 그 후, 탈이온수 (6 ML)으로 추출 (2 ML)를 섞어, 그리고 C-18 고체 상 추출에 직접 (8 ML)이 믹스를 적용합니다.
- 샘플을 로딩하기 전에 전제 조건 물 2 ML 다음 acetonitrile 2 ML과 rinsing에 의한 C-18 고체 상 추출 칼럼.
- 샘플을 로딩 후 열은 acetonitrile / 물 (85분의 15, V / V) 2 ML 뒤에 물을 2 ML로 씻어 있습니다. HPLC 분석 (FB1를 포함)에 대한 샘플은 acetonitrile / 물 (30분의 70, V / V) 2 ML로 eluted있다.
- 0.1 ML borate 완충액 (0.05 M 붕소의 acid/0.05 M 나트륨 borate는 [50분의 50, V / V], 산도 8.5)과 0.1가 담긴 병을로 열 eluate의 0.1 ML를 전송하여 O-phthaldehyde (오파)으로 FB1를 Derivatize ML 오파 (aceton에서 0.1 밀리그램 / ML메르 캅 토 에탄올) - 0.5 %로 itrile.
- acetonitrile/0.01 M 붕산 (60분의 40, V / V) 0.5 ML을 추가하여 10 분 후에 반응을 중지합니다.
- 분석 Zorbax ODS 컬럼 (4.6 150mm)과 가변 파장 Shimatzu RF-10Axl 형광 검출기 (여기 335 nm의 / 방출 440 nm의)이 장착된 HPLC Shimadzu LC-20AT 시스템에 FB1를 분석합니다.
- 선형 그라데이션을 사용 (용매 : acetonitrile/0.1 M의 인산 나트륨 (60분의 40), 산도 3.3, 용매 B : acetonitrile / 0.1 M의 인산 나트륨 (40분의 60), 산도 3.3)되어 다음과 같이하고 기울기 프로그램입니다 : 100 % 5 분, 10 분, 100 % B의 100 % B에.
- HPLC에 의해 FB1 기준을 분석하고, 피크 면적 측정은 표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 그 후, FB1 표준 곡선과 피크 영역을 비교하여 시료의 FB1 수준을 계량.
5. Ergosterol 분석
- 7~14일을위한 옥수수 커널의 문화 균류.
- 필로폰 : 잠복기 후, 클로로포름 10 ML 추가각 유리병에 anol (2시 1분, V / V). 추가한 후에는 잘 샘플을 흔들 후 24 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 튜브를 품어.
- 24 시간 후 샘플을 원심 분리기, 그리고 표면에 뜨는를 수집하고 0.45 음 나일론 막 통해 필터링합니다.
- 직접 4.6 U ODS-C18 컬럼 (200, 250 ± 4.6 ㎜)와 Shimadzu SPD-20A의 UV / 282 NM에서 모니터링하도록 설정 VIS 검출기를 갖춘 HPLC Shimadzu LC-20AT 시스템으로 샘플을 주사.
- 1.5 ML / 모바일 위상과 같은 분 유량에 메탄올 (100 %)를 사용합니다. HPLC 등급 ergosterol에서 생성된 표준 곡선에 샘플 피크 영역을 비교하여 샘플에 ergosterol의 부량를 결정합니다.
6. 대표 결과
2~3일위한 습도 챔버에 접종 및 배양 후, 곰팡이 성장은 커널에 표시하기 시작합니다. 이레 게시물 치료, 치료 식물에 대한 식물의 성장은 whil 명확하게 표시합니다온라인 모의 컨트롤 (그림 1B, 상단) 감염되지 않은 있어야합니다. 더 이상 부화 기간이 더 풍부한 식물 성장 (그림 1B, 아래)에 도움이됩니다. 조건에서 본 설명 (그림 2G), A. flavus 야생 형 NRRL 각각 8, 6, 8 일간의 식민지, 아플라톡신 축적 및 conidia 생산의 3,357 표시된 최대 값 (그림 2, AC). 그러나 진균 독소 오염과 conidiation은 ergosterol의 단위당 비교했을 때, 가장 큰 수준 (그림 2, DE) 각각 4, 6 일간에서 관찰되었다. 그림 층이 곰팡이 바이오 매스에 의존 최대 가치 관찰을 요약한 것입니다. 흥미롭게도 4-6일 포스트 접종 사이 커널은 같은 시간 코스 (그림 2 시간, 아래)에 대한 시료로부터 총 RNA에 의해 볼 핵산 저하를 받고있다.
우리 자신을 포함하여 몇몇 연구, 조사할을 가지고에드 F. verticilliodies는 옥수수 커널 2,8,9,10,11,12에 감염 성공적으로 시간을 관찰을위한 포인트로 7-13일 사용됩니다. 방법을 사용하면 본 설명한 3,500-8,000 NG / G 커널 4,13 및 ergosterol 수준 범위에서 fumonisin 레벨 범위 fumonisin (상단) 및 ergosterol (하단위한 5,000-10,000에서 NG / G 커널 14,13. 그림 3은 쇼를 대표하는 봉우리 ) HPLC chromatograms에서. ergosterol의 측정도 흡광 스펙트럼 15를 통해 진행하실 수 있습니다.
그림 1. 곰팡이 바이오 매스, sporogenesis 및 진균 독소 생산과 커널 bioassays에서 식물 성장을위한 대표적인 결과의 부량을위한 플로우 차트. 옥수수 커널에 곰팡이 pathogenesis을 평가하는 데 사용되는 기본적인 생물 학적 매개 변수의 부량위한 설명한 방법을 요약) 플로우 차트. B) 대표커널 bioassays에 대한 검색 결과. 탑, A. flavus (NRRL3357) B73 유전자를 배경으로 옥수수 커널에서 식물 성장. 씨앗 10 6 포자 / ML 및 사진 200 μl 7 일 게시물 접종 찍은 사진으로 주사되었다. 아래에, F. verticillioides는 B73 배경 13일 포스트 감염에 커널을 주사. 커널은 10 6 포자 / ML 200 μl으로 주사되었다.
그림 2. Aspergillus flavus의 커널 bioassay 시간 코스. B73 커널은 10 6 포자 / ML Aspergillus flavus conidial 정지 200 μl로 주사하고 2~8일 (G)에 incubated했다. (; 평균 ± SE N = 3-4) 모든 값은는 4 커널의 건조 중량 평균으로 결정됩니다. ) 콜로니 (ergosterol을 기준으로), (B) 아플라톡신, 그리고 (C) conidiation은 위에서 설명한 방법을 사용하여 계량했다. E) 아플라톡신 및 (F) conidiation이 표시됩니다H ergosterol를 통해 측정으로 곰팡이 바이오 매스의 함수로. F) ergosterol, 아플라톡신 축적, 그리고 곰팡이 바이오 매스의 함수로 conidiation위한 최대 값 - 각 수량에 대한 최대 값을 100 %로 설정되었다 관찰했다. 시간 코스의 총 RNA의 차선 당 (H) 1 μg.
그림 3. fumonisin B1 (위)과 Fusarium의 verticillioides (M3125)에 감염된 커널과 분리돼 ergosterol (아래)를위한 대표적인 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC) chromatograms.
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Discussion
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Acknowledgments
우리는 그들의 기술 지원을 위해 브랜든 Hassett과 카를로스 오르 티즈 감사드립니다. 이 작품은 박사 마이클 Kolomiets에 NSF 교부금 IOB-0544428, IOS-0951272, 그리고 IOS-0925561에 의해 지원, 그리고 식량 농업 USDA의 국립 연구소 (NIFA), AFRI 공장 사육 및 교육 그랜트 # 2010-85117하여 -20539 Drs 있습니다. 세스 머레이, 토마스 Isakeit, 그리고 마이클 Kolomiets.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientific | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Blender | Vicam | 20200 | |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 | |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 | |
| Afla Test column | Vicam | G1024 | |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 | |
| Methanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | AC14952-0025 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC39769-0025 | |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientific | 60108-304 | |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma-Aldrich | 79760-5g | |
| Boric acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Sodium borate | Fisher Scientific | RDCS0330500 | |
| Mercapt–thanol | Fisher Scientific | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Corporation | LC-20AT | |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Corporation | RF-10AXL | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | AC38987-0010 | |
| FB1 standards | Sigma-Aldrich | F1147-1mg | |
| Chloroform | VWR international | MK444410 | |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Corporation | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Scintillation vials | VWR international | 66021-602 | |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -H., Shim, W. -B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
