Summary
Visualisering av kranskärlen är avgörande för att öka kunskaperna om hjärt-kärlsjukdomar. Här beskriver vi en metod för perfusion murin kranskärlen med en röntgentät silikongummi (mikrofilter), som förberedelse för mikro-datortomografi (μCT) avbildning.
Abstract
Visualisering av kärlsystemet blir allt viktigare för att förstå många olika sjukdomstillstånd. Medan flera tekniker finns för avbildning kärlsystemet, några har möjlighet att visualisera det vaskulära nätverket i sin helhet, medan sträcker sig till en resolution som innehåller mindre fartyg 1,2. Dessutom har många vaskulära gjutning förstöra den omgivande vävnaden, vilket förhindrar ytterligare analys av provet 3-5. En metod som kringgår dessa frågor är mikro-datortomografi (μCT). μCT avbildning kan skanna i upplösningar <10 mikrometer, kan producera 3D-rekonstruktioner av det vaskulära nätverket och lämnar vävnaden intakt för senare analys (t.ex. histologi och morfometri) 6-11. Kräver dock avbildning fartyg genom ex vivo μCT metoder som fartygen fyllas med en radiopak förening. Som sådan är den exakta återgivning av kärl som produceras av μCT avbildning knutentillförlitlig och fullständig fyllning av fartygen. I detta protokoll, beskriver vi en teknik för att fylla mus kranskärlen som förberedelse för μCT avbildning.
Två dominerande tekniker finns för att fylla kranskärlen: in vivo via kanylering och retrograd perfusion av aortan (eller en gren i aortabågen) 12-14, eller ex vivo genom en Langendorff-perfusion systemet 15-17. Här beskriver vi en in vivo-aorta kanylering metod som är speciellt utformade för att säkerställa fyllning av alla fartyg. Vi använder en låg förening viskositet röntgentät kallas mikrofilter som kan perfundera igenom minsta fartygen för att fylla alla kapillärerna, samt både arteriella och venösa sidan av vaskulära nätverket. Kärlen perfuserades med buffert med användning av en trycksatt perfusionssystem, och fylldes sedan med mikrofilter. För att säkerställa att mikrofilter fyller de små högre motstånd fartyg ligera vi stora grenar emanating från aorta, vilken avleder mikrofilter i kranskärlen. När fyllning är klar, för att förhindra den elastiska natur hjärtvävnad från att klämma mikrofilter av vissa fartyg, underbinda vi tillgängliga större vaskulära uttagspunkter omedelbart efter påfyllning. Därför är vår teknik optimerad för fullständig fyllning och maximal retention av fyllmedel, vilket möjliggör visualisering av hela koronar vaskulära nätverk - artärer, kapillärer och vener lika.
Protocol
1. Förberedelser innan du börjar
- Fylla varje sida av det tryck perfusionsapparat med Kärlvidgande medel-buffert (4 mg / L Papaverin + 1 g / L Adenosin i PBS) eller 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, respektive.
- Förbered en 1/2cc insulinspruta (med en permanent fastsatt 29G ½ "nål) genom att fylla den med 0,1 ml 1:100 Heparin (5000E/ml materiel) och böja nålen till ~ 120 graders vinkel med avfasningen uppåt. Gör det samma sak med en 1 ml spruta (med en 26G ½ "nål) fylld med 0,3 ml mättad KCl-lösning.
2. Exponering av hjärtat och kanylering aorta
- Bedöva musen med din narkos val. (Vi använder en överdos av en ketamin / xylazin blandning. IP-injektion av 130 mg / kg Ketamin och 8,8 mg / kg Xylazin i saltlösning)
- Nåla fast sövd musen på dissekera facket ventrala uppåt. Öppna bukhålan med en mittlinjeincision och dras tillbaka i hudenatt exponera de organ. Flytta tarmarna till ena sidan för att exponera ett område av den bakre vena cava (PVC).
- Injicera Heparin lösning in i PVC. När du extrahera nålen täcker nålen hålet med en bomullspinne för att förhindra läckage och håll den i några sekunder tills PVC väggen blodproppar och tätningar. Vänta 2-3 minuter för heparin för att dispergera hela mus cirkulationen.
- Dissekera membranet och bröstkorgen så att du kan observera att slå hjärtat. Injicera långsamt KCl-lösning i PVC tills hjärtat gripanden.
- Avlägsna alla organ nedanför membranet och skära ut bakre delen av mus, vilket lämnar den region främre hos membranet intakt. Ta bort membranet, är noga med att skära PVC nära membranet så den del närmast hjärtat är lätt att hitta i efterföljande steg.
- Leta den avskurna ändan av aorta. Placera en lång längd av 6-0 flätad silkesutur under aorta några millimeter främre tillbakam den skurna änden, så att suturen är fördubblad tillbaka på sig själv. Klipp denna längre sutur på mitten så finns det 2 stycken sutur under aorta. Sätt angiokateter i den avskurna ändan av aorta (Figur 1 A, B) och knyta varje sutur med en dubbel-knut för att hålla angiokateter på plats och förhindra mottryck i aorta från att läcka ut.
3. Perfusion och mikrofilter injektion
- Anslut angiokateter till trycket perfusionsapparaten (Fig. 2) och börja perfusion av fartyg med vasodilaterande buffert (figur 1C) genom att pumpa perfusion apparaten för en körning tryck på 100-110 mmHg. Dubbelkolla att buffert perfusion genom kranskärlen genom att vätska kommer ut från PVC. Fortsätter att perfundera i minst 3 minuter eller till dess att vätskan som lämnar PVC är klar. (Fortsätt med nästa steg, medan perfusion).
- Dissekera revbenen och PIN rygg (eller ta bort) bröstkorgen att exponera hjärtat. När exponerade, vara careful att inte låta hjärtat torka ut genom att klämma droppar buffert på hjärtat från ett buffert-dränkt bit gasväv. Rensa bort tymus för att exponera aortabågen. Ligerar de tre stora aorta grenar med 6-0 flätad silkesutur att säkerställa vätska avleds genom kranskärlen snarare än genom dessa stora, låga motstånd fartyg (figur 1D).
- Perfundera hjärtat med fixativ i 15 minuter och skölj sedan med Vasodilatation buffert i minst 2 minuter. Under tiden ligera både anterior vena cavae att förhindra mikrofilter från att läcka ut från hjärtat efter injektion (Fig. 1E). Placera suturer kring PVC och aorta men dra inte åt dem förrän efter påfyllning.
- Framställa mikrofilter (såsom anges i tabell av reagens) och ladda den i en 1 ml spruta. Fylla dissektion brickan med tillräckligt med vatten för att täcka katetern (för att förhindra införande av luftbubblor vid byte från perfusionsslangen till mikrofilter spruta). Koppla perfusionen apparatus från katetern och ansluter den preparerade mikrofilter spruta.
- Injicera mikrofilter i aorta tills god fyllning av kranskärlen är uppenbar (fig 1 F, 3A): artärerna fyller först, och därefter mikrofilter kommer "spilla" in i kapillärerna som vävnadskälla spolningar med färgen på mikrofilter. En gång på den venösa sidan, orsakar den hydrofoba naturen hos mikrofilter det att initialt visas som oberoende sfärer då det kommer ut från de små kärlen. Fortsätt att injicera mikrofilter tills en kontinuerlig kolumn fyller venerna. Fullständig fyllning kommer att vara uppenbart när mikrofilter är kontinuerliga inom kärlen, och den går ut genom PVC.
- Efter fyllning är fullständig, snabbt dra åt suturer som tidigare placerats runt PVC och aortan för att förhindra den elastiska naturen hos hjärtvävnaden från klämma mikrofilter av kärlen.
- Täck hjärtat med våta gasväv (indränkt med vatten från skärande facket) För att förhindra dess uttorkning, och låta det stå under approximativt 1 timme vid rumstemperatur tills mikrofilter har polymeriserats. Undvik yttre tryck på hjärtat under polymerisationsprocessen, såsom att lyfta eller vrida hjärtat i ett försök att få en tidig bild av de fyllda kärl på baksidan av hjärtat. Detta kan pressa mikrofilter från vissa fartyg till en mer elastisk område av hjärtat, vilket avbrott i mikrofilter.
- Ta bort hjärtat och post-fixa det i 4% PFA natten vid 4 ° C. Därefter lagras i 70% etanol vid 4 ° C. Hjärtat vaskulatur är nu klar för μCT avbildning.
4. Representativa resultat
Fartyg som faktiskt perfunderade med mikrofilter har kontinuerlig, obruten mikrofilter hela fartyg (Fig. 3A). Omfattningen av fyllning av kranskärlen kan bedömas med ögat, vener epikardiellt ligger 18 och kan lätt observeras (figur 3A, pilspets), artärer,som är mer intrahjärtmuskeltryck 18, är också synliga genom ytan av hjärtat (fig 3A, pil). Kapillär fyllning är också uppenbart, eftersom hjärtvävnad har en mycket hög täthet av kapillärer, och därför, när kapillärerna fyllning kommer hjärtvävnad i jämnhöjd med färgen på mikrofilter (fig. 3A, stjärna). Sålunda kommer alla vaskulära nätverk som misslyckades att fylla vara märkbara på grund av bristen av mikrofilter (fig. 3B, C).
Diskontinuiteter i mikrofilter (asterisker i fig 3B) uppträder ofta på grund av den hydrofoba naturen hos mikrofilter kommer att få den att kontrahera i sig och orsaka "bryter" inom fyllda kärlen. Dessa "pauser" kan minskas om trycket i kärlen upprätthålls genom lämplig tie-offs av vaskulära uttagspunkter från hjärtat. Andra diskontinuiteter kan orsakas av luftbubblor inom mikrofilter. För att förhindra införandet av luften, se till att angiokateter helt nedsänkt i vatten när du byter från perfusionen ap paratus till mikrofilter sprutan. Om en luftbubbla införes, kan det ofta avlägsnas helt enkelt genom att fortsätta mikrofilter perfusionen tills bubblan har tryckts genom och ut ur kranskärlen.
Vaskulära nätverk kan inte fyllas helt om en del av den vaskulära bädden är blockerad (fig. 3B, pil). Medan Heparin hämmar bildningen av blodproppar, kan enstaka stopp förekommer fortfarande på grund av ofullständig Heparin perfusion innan du påbörjar proceduren, eller på grund av andra okända faktorer. Om en blockering inträffar, finns det, såvitt vi vet, inte någon metod för att driva bort blockeringen för att fullborda den vaskulära fyllningen. Ofullständig fyllning kan också uppstå om för lite tryck används under fyllning, eftersom mikrofilter inte kommer att tvingas in i alla de vaskulära sängar och kapillära nätverk (Fig. 3C). Omvänt kan för mycket tryck orsaka kapillärerna att brista och extravasera mikrofilter i den omgivande vävnaden (Fig. 3D).
files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. Översikt över mikrofilter perfusion systemet. (A) Aortan och PVC skärs ungefär vid nivån för membranet. (B) aortaascendens kanyleras med en angiokateter. (C) Vasodilatation buffert perfuseras genom kärlen och drivs av trycket perfusionsapparaten (ej på bild), medan (D) de tre huvudgrenar utanför aortabågen är ligeras. (E) 4% PFA perfunderas genom kranskärlen medan båda Anterior Vena Cava ligeras. (F) med hjälp av en spruta, mikrofilter perfuseras genom kranskärlen tills det observeras utträder från PVC.
Figur 2. Perfusionsapparaten. Är två Erlenmeyerkolvar, var fylld med antingen Vasodilatation buffert eller 4% PFA och gick och trycksatt via rören kopplade till sina sidovapen. Systemet trycksätts genom manuell pumpning avglödlampa, och en tryckmätare är ansluten till en av kolvarna för att möjliggöra övervakning och underhåll av tryck. Små rör sträcker sig genom gummiproppar och ned in i vätskan i varje kolv. Tryck in från sidovapen pumpar vätska från varje kolv ut dessa mindre rör. Rören samman sedan vid en avstängningskran som bara tillåter fluid att flöda från en kolv vid en tidpunkt.
Figur 3. Prova mikrofylld hjärtan. (A) Fartyg som är fyllda väl kommer har få (om någon) avbrott i mikrofilter, och hjärtat vävnad kommer att vara färgade färgen på mikrofilter på grund av den fyllda kapillärer (stjärna, och jämför med C). Både artärer (pil - vänstra främre nedåtgående artär) och vener (Arrowhead - Vänster koronarven) är synliga genom hjärtat ytan. (B) Ett hjärta med avbrott i mikrofilter (asterisker) samt blockeringar i vissa fartyg som hindrade hela Microfil penetration. De blockerade kärl förblir röd (pil), eftersom blodet inte spolades ut under perfusionen processen. (C) Ett hjärta med fartyg som ofullständigt fylldes. Lägg märke till vävnaden inte har tagit den gula färgen på mikrofilter, vilket indikerar mikrofilter inte tränga in i kapillärerna. (D) En hjärtat där kapillärerna skur under fyllning, vilket orsakar att mikrofilter att läcka in i den omgivande vävnaden (pil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjärtvävnad har en mycket hög metabolisk efterfrågan, och därför kräver en konstant tillförsel av näringsämnen och syre från blodet levereras av kranskärlen. Sjukdomar i hjärtats kranskärl, vilket minskar koronar funktion på grund av fartygets stenos och blockering, kan leda till hypoxi och ischemi, och sätta drabbade patienter med risk för hjärtinfarkt och irreparabel skada på hjärtmuskeln. En bättre förståelse av den sjuka tillståndet för dessa fartyg är nödvändigt och avgörande för vår förmåga att studera hjärtats kranskärl är visualisering av kärlsystemet. Här presenterar vi en metod för framställning av murin kranskärlen för ex vivo-avbildning genom att fylla kärlen med ett röntgentätt material. Detta protokoll har utformats särskilt för att säkerställa fullständig fyllning och därefter visualisering av alla kranskärlen, inklusive kapillärer.
För att säkerställa fullständig fyllning av allt kapillärer, fyllningen agent, mikrofilter, måste injiceras i en delvis sluten system som kommer att tvinga mikrofilter i de mindre, högre beständighet fartyg inom det vaskulära nätverket. För att skapa detta partiellt avslutande i vår in vivo fylla systemet, ligera vi tre större, låga motstånd artärer förgrenas från aortabågen. Även om detta inte utesluter alla andra möjliga "läckage" punkter, de återstående kärl (huvudsakligen de interkostala artärer) är tillräckligt liten för att något tryck förloras genom dem inte interfererar med fullständig fyllning av koronar vaskulära systemet. När mikrofilter har perfuseras alla fartyg i hjärtat kommer medfödda elastiska natur hjärt-och kärlvävnad pressa mikrofilter av vissa fartyg. För att förhindra denna förlust av mikrofilter, underbinda vi alla stora och tillgängliga utgångspunkternas nämligen både överlägsen hålvenen, den bakre vena cava och aorta, efter kranskärlen helt perfunderade. På detta sätt är trycket maintained i hjärtat tills mikrofilter polymeriserar, vilket tillåter mikrofilter för att överensstämma med kärlet strukturen under normala fysiologiska blodtryck.
Alternativt, om visualisering av kapillärerna inte krävs, är det också möjligt att fylla endast de arteriella eller endast den venösa kärlbäddar. Mer viskösa versioner av mikrofilter kan blandas med användning av en hög viskositet utspädningsmedel (tillgänglig från Flowtech). Den mer viskösa perfusatet är oförmögen att tränga igenom kapillärerna, och därför tillåter visualisering av endast de artärer, eller endast de vener om perfuseras från den venösa sidan. Dessutom lade protokollet här kan lätt anpassas till andra arter eller icke-vuxna möss. Skalning av förfarandet för att lämpligt passa storleken av det djur kräver bara att katetern och perfusionen slang är korrekt dimensionerat för att djurets aortan för att minimera läckage och för att förhindra sträckning eller sönder. Volymerna av vätskor injiceras (dvs. heparin,mättad KCl och den mikrofilter) måste också vara lämpligt skalat.
Vår protokollet specifikt utformad för injektion av mikrofilter och bildbehandling med μCT, men kan det lätt anpassas för andra fyllmedel, antingen för μCT analys, eller andra ex vivo avbildningstekniker. När du letar efter μCT kompatibla fyllmedel, finns det flera alternativ för röntgentäta färgämnen, så många ämnen som används för fyllning och studera kärlsystem via andra avbildningsmetoder (t.ex. akryl) kan infunderas med radio ogenomskinligt material, såsom en ledande pigment 9 eller en osmium-lösning 3. Oavsett vilken fyllning som används medlet erbjuder μCT avbildning fördelen att resultaten kan rekonstrueras till en 3D-modell för att ge vaskulära mätningar samt strukturell information om förgrening mönster de fyllda kranskärlen 6,7,14,19. Dessutom bevarar avbildning av μCT den omgivande vävnaden, vilket möjliggör för ytterligare enalyses efter sökningen. Sålunda kan fyllas och skannas hjärtan bearbetas för histologisk analys, och sektioner färgades för olika markörer kan inriktas med μCT data till korrelera arteriella / venösa identitet, närvaron av glatta muskelceller skikt, eller ytterligare histologiska index.
Andra vanliga vaskulära avbildningstekniker kräver också vaskulär fyllning och vår protokoll kan enkelt anpassas för perfusion av kranskärlen med någon av dessa andra fyllmedel. Svepelektronmikroskopi (SEM) kräver fyllning av kärl och sedan upplösning av den mjuka vävnaden bort från den etablerade vaskulär gjutna i en process som kallas korrosion gjutning. För att bibehålla formen på fartyg utan stöd av den omgivande mjuka vävnaden, måste fyllmedlet vara starkt och icke-sprött: ofta en akrylharts (t ex MercOx, Batson s) 3,20,21. Även SEM ger scanning resolutioner vida överlägsen den hos μCT avbildning 22, korrosion gjutnaIng förfarande förstör vävnaden och förhindrar ytterligare vävnad analys. En annan metod för ex vivo-avbildning av kranskärlen, optisk projektionstomografi (OPT) kan detektera synligt eller nära-synligt ljus, och sålunda möjliggör detektion av fluorescerande signaler förutom kromogena fällningar såsom purpurfärgad utfällning som produceras av alkaliskt fosfatas omvandling av BCIP / NBT-(5-brom-4-klor-3-indolyl phosphate/4-nitro tetrazolium) 23-25. Visualisering av fartyg, därför, kan åstadkommas antingen genom fyllning med en fluorescerande substans (t.ex. PU4ii: en polyuretanharts 3, eller fluorescein infunderas dextran 26), eller genom icke-fyllning metoder, såsom Whole-mount immunodetektion via antingen fluorescens eller en histokemiska kromogent fällning (t.ex. BCIP / NBT) 23. OPT avbildning kan uppnå upplösning något bättre än den hos μCT (till omkring 1 mikron), men för både fyllning och immunodeteInsatser metoder den omgivande mjuka vävnaden måste vara kemiskt bort, vilket kan störa vissa antigener för histologisk analys efter avsökning.
Det finns också ett flertal metoder för avbildning av kranskärlen som inte kräver vaskulär fyllning eller immunodetektion och som sådana kan utföras in vivo. En teknik, kontrastförstärkning högupplöst Ultraljud (CEHRUS), utnyttjar gasfyllda mikrobubblor som kontrastmedel. Injektion av dessa mikrobubblor i blodet möjliggör visualisering av flödet av blod i realtid flödesmätningar ner till kapillär nivå, men det ger inte en 3D-vy av de avbildade fartygen 2,27-31. En annan metod har Magnetic Resonance angiografi (MRA) också använts för att avbilda kranskärlen 32-34 och senaste framstegen inom MRA har förlängt sina bildhanteringsfunktioner att få realtid blod flödesmätningar 35,36. Medan MRA kan producera 3D-rekonstruktioner av vessels avbildade, resolutionen av ömsesidigt erkännande är för närvarande begränsad till cirka 100 mikrometer, och därför misslyckas med att identifiera mindre fartyg (kapillärer arterioler och venoler).
Eftersom både CEHRUS och MRA kan utföras på levande djur, erbjuder de fördelen av upprepade och icke-invasivt övervakning blodflöde och vaskulär utveckling. Emellertid den relativt låga upplösningen av MRA och avsaknaden av 3D-funktionerna från CEHRUS hindra avbildning av den koronara nätverket som helhet. Således ex vivo imaging tekniker som kräver vaskulära fyllmedel eller immunodetektion är viktiga för att få hög upplösning 3D-information för koronar kärlsystemet, medan in vivo tekniker ger värdefull information om funktionaliteten hos vaskulära nätverket (dvs. flödesdata) över tiden . Kombinera in vivo tidsförloppet analys med slutpunkt ex vivo imaging ger ett kraftfullt system för undersökning av kranskärlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Möss hanteras med metoder som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Washington och i enlighet med vägledningen för vård och användning av försöksdjur publicerad av US National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, reviderad 1996).
Acknowledgments
Vi tackar Dr Kelly Stevens för de första försöken av protokollet, Dr Michael Simons, Dr Kip Hauch, och medlemmar av båda sina labb för allmän diskussion.
Detta arbete är stöd från NIH bidrag HL087513 och P01 HL094374.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes |  BD Biosciences |
BD-309602 | |
| 1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles | BD Biosciences |
BD-309306 | |
| 2" x 2" Gauze pads | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾" Angiocath IV catheter | BD Biosciences |
BD-381112 | |
| 26G ½"gauge needles | BD Biosciences |
BD-305111 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich |
A9251 | 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine) |
| Angled Graefe Forceps | Fine Science Tools |
11052-10 | |
| Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile | Cardinal Health |
C15055-006 | |
| Curved Surgical Scissors | Fine Science Tools |
14085-09 | |
| Dissecting stereoscope and light source | Nikon Instruments |
NA | NA |
| Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches | Cole-Parmer |
YO-10915-12 | Filled with tar for pinning down the mouse |
| Fine Curved Forceps | Aesculap |
FD281R | Need two |
| Heparin, 5000 U/ml stock | APP Pharmaceuticals |
NDC 63323-047-10 | 1:100 dilution in water |
| KCl | Fisher Scientific |
P217 | Saturated solution in H2O |
| Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline |
| Microfil | FlowTech |
MV-122 (yellow). Other color options are also available. | Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed |
| Non-sterile Suture: 6-0, braided silk | Harvard Apparatus |
723287 | |
| Papaverine | American Regent Inc. |
NDC 0517-4010-01 | 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich |
P6148 | Prepared as 4% solution |
| Perfusion Apparatus | See figure 2 | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools |
15018-10 | |
| Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock | Lloyd, Inc. |
NADA #139-236 | Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline |
References
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
- Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
- Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
- Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
- Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
- Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
- Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
- Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
- Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
- Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
- Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
- Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
- Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
- Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
- Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. , Cold Spring Protoc. 586-594 (2011).
- Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
- Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
- Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
- Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
- Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
- Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
- Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
- Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
- Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
- Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
- Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. , 254-441 (2010).
