Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

إلى الوراء الإرواء وملء الأوعية الدموية التاجية الفأر كما التحضير للتصوير المقطعي بالكمبيوتر مايكرو

doi: 10.3791/3740 Published: February 10, 2012

Summary

تصور من الأوعية التاجية أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لأمراض القلب والأوعية الدموية. نحن هنا وصف طريقة لperfusing الأوعية الدموية التاجية الفئران مع ظليل للأشعة مطاط السيليكون (Microfil)، تحضيرا للالدقيقة المحسوبة التصوير (μCT) التصوير المقطعي.

Abstract

تصور من الأوعية الدموية تزداد أهمية لفهم كثير من الحالات المرضية المختلفة. في حين أن العديد من التقنيات المتبعة لتصوير الأوعية الدموية، قليلة هي قادرة على تصور شبكة الأوعية الدموية ككل في حين تمتد إلى قرار يتضمن 1،2 السفن الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، العديد من تقنيات الصب الأوعية الدموية تدمير الأنسجة المحيطة بها، ومنع مزيد من التحليل للعينة 3-5. أسلوب واحد والتي تلتف حول هذه القضايا الصغيرة التصوير المقطعي (μCT). يمكن μCT التصوير تفحص بدقة <10 ميكرون، قادر على انتاج اعادة البناء 3D لشبكة الأوعية الدموية، ويترك الأنسجة السليمة للتحليل لاحقة (على سبيل المثال، الأنسجة وقياس الأشكال) 6-11. ومع ذلك، السفن التصوير بواسطة أساليب السابقين μCT فيفو يتطلب أن يكون ملء السفن مع مجمع ظليل للأشعة. على هذا النحو، تمثيل دقيق من الأوعية الدموية التي تنتجها التصوير μCT مرهونموثوق بها وكاملة ملء الأوعية. في هذا البروتوكول، وصفنا أسلوبا لملء الأوعية التاجية الماوس في التحضير لتصوير μCT.

وجود اثنين من التقنيات السائد لملء الأوعية الدموية في الشريان التاجي: في الجسم الحي عن طريق نضح إقناء؛ إدخال القنية ورجعية من الشريان الأبهر (أو فرع قبالة قوس الأبهر) 12-14، أو المجراة سابقا عن طريق نظام نضح Langendorff 15-17. هنا نحن تصف في الشريان الأورطي فيفو طريقة إقناء؛ إدخال القنية التي تم تصميمها خصيصا لضمان ملء جميع السفن. نستخدم ظليل للأشعة منخفضة اللزوجة مركب يسمى Microfil التي يمكن أن يروي من خلال أصغر السفن لملء جميع الشعيرات الدموية، وكذلك كلا الجانبين الشرياني والوريدي في شبكة الأوعية الدموية. وperfused السفن مع العازلة باستخدام نظام نضح الضغط، وشغل بعد ذلك مع Microfil. للتأكد من أن Microfil يملأ المراكب الصغيرة أعلى مقاومة، ونحن ligate فروع كبيرة emanatinز من الشريان الأورطي، والذي يحول Microfil في الشرايين التاجية. تعبئة مرة واحدة كاملة، لمنع طبيعة مرونة من أنسجة القلب من الضغط Microfil من بعض السفن، ونحن ligate الوصول الرئيسية مخارج الأوعية الدموية فورا بعد ملء. ولذلك، تم تحسين تقنية لدينا ملء كاملة والاحتفاظ بها إلى أقصى حد من وكيل تعبئة، مما يتيح تصور للشبكة كاملة الأوعية الدموية التاجية - الشرايين، والشعيرات الدموية، والأوردة على حد سواء.

Protocol

1. الاستعدادات قبل انطلاق

  1. ملء كل جانب من الضغط جهاز نضح مع عازلة عائي (4mg / L الببافرين + 1G / L الأدينوساين في برنامج تلفزيوني)، أو لامتصاص العرق 4٪ (منهاج العمل) في برنامج تلفزيوني، على التوالي.
  2. تحضير حقنة الأنسولين 1/2cc (مع 29G تعلق بشكل دائم ½ "إبرة) عن طريق ملئه مع 0.1 مل من 1:100 الهيبارين (5000U/ml الأوراق المالية)، والانحناء الإبرة إلى زاوية ~ 120 درجة مع شطبة تصل. هل نفسه مع حقنة 1 مل (بإبرة 26G "½) مليئة 0.3 مل بوكل حل المشبعة.

2. كشف القلب والشريان الأورطي cannulating

  1. تخدير الماوس باستخدام مخدر لكم الاختيار. (ونحن نستخدم جرعة زائدة من خليط الكيتامين / زيلازين: حقن IP من الكيتامين مغ / كغ 130 و 8.8 ملغم / كغم من زيلازين في المياه المالحة)
  2. دبوس الماوس تخدير على علبة تشريح، بطني حتى الجانب. فتح تجويف البطن مع شق خط الوسط وسحب الجلدللكشف عن الأجهزة. تحرك الأمعاء إلى جانب واحد لفضح منطقة من الوريد الأجوف الخلفي (PVC).
  3. حقن محلول الهيبارين في بولي كلوريد الفينيل. كما يمكنك استخراج إبرة، تغطية ثقب إبرة مع قضيب من القطن ذات الرؤوس لمنع تسرب وأنه عقد لبضع ثوان حتى جلطات جدار بولي كلوريد الفينيل والأختام. الانتظار 2-3 دقائق للهيبارين لتفريق طوال الدورة الدموية الماوس.
  4. تشريح الحجاب الحاجز والقفص الصدري حتى تتمكن من مراقبة قلب ينبض. حقن ببطء بوكل حل في PVC حتى الاعتقالات القلب.
  5. إزالة جميع الأجهزة أسفل الحجاب الحاجز واستئصال جزء الخلفي من الماوس، وترك المنطقة الأمامية من الحجاب الحاجز سليمة. إزالة الحجاب الحاجز، والحرص على لقطع البلاستيك بالقرب من الحجاب الحاجز وبالتالي فإن الجزء القريب إلى القلب من السهل تحديد موقع في الخطوات اللاحقة.
  6. تحديد نهاية قطع من الشريان الأورطي. مكان واحد طول فترة طويلة من 6-0 خياطة الحرير مضفر تحت الشريان الأورطي بضعة ملليمترات الأمامي جيئة وذهابام نهاية القطع بحيث يتم مضاعفة خياطة مرة أخرى على نفسه. قطع هذا يعد خياطة في النصف حتى أن هناك 2 قطعة من الخيط تحت الشريان الأورطي. إدراج angiocatheter في نهاية قطع من الشريان الأبهر (الشكل 1A، B) وربط كل الخيوط مع عقدة مزدوجة لعقد angiocatheter في مكان ومنع أي خلفية الضغط داخل الشريان الأورطي من تسرب.

3. نضح وحقن Microfil

  1. ربط angiocatheter لضغوط جهاز نضح (الشكل رقم 2) والبدء في perfusing الأوعية العازلة مع عائي (الشكل 1C) عن طريق ضخ جهاز نضح لضغط القيادة من 100-110 مم زئبق. مضاعفة التحقق من أن المخزن المؤقت perfusing من خلال الشرايين التاجية عن طريق ضمان وسائل الخروج من PVC. تواصل يروي ما لا يقل عن 3 دقائق أو حتى السائل الخروج من PVC واضح. (متابعة الخطوات المقبلة في حين perfusing.)
  2. تشريح الأضلاع والظهر دبوس (أو إزالة) القفص الصدري لكشف القلب. تعرض مرة واحدة، يكون كاليفورنياreful عدم السماح للقلب تجف من خلال الضغط على قطرات من عازلة على القلب من قطعة عازلة غارقة من الشاش. ازالة الغدة الصعترية لفضح قوس الأبهر. Ligate على ثلاثة فروع رئيسية الأورطي باستخدام 6-0 خياطة الحرير مضفر لضمان السوائل يتم تحويل عن طريق الشرايين التاجية وليس من خلال هذه أكبر والأوعية مقاومة منخفضة (الشكل 1D).
  3. يروي القلب مع مثبت لمدة 15 دقيقة، ثم شطف مع توسع الأوعية العازلة ما لا يقل عن 2 دقيقة. وفي الوقت نفسه، على حد سواء الأمامية ligate الوريد الأجوف لمنع Microfil من تسرب للقلب بعد حقن (الشكل 1E). مكان الغرز حول بولي كلوريد الفينيل والشريان الأورطي ولكن لا تشديد لهم حتى بعد تعبئة.
  4. إعداد Microfil (كما هو محدد في جدول الكواشف) وتحميله في حقنة 1 مل. ملء علبة تشريح مع ما يكفي من المياه لتغطية القسطرة (وذلك لمنع دخول من فقاعات الهواء عند التبديل من أنابيب التروية إلى الحقنة Microfil). قطع وكالة اسوشييتد برس نضحparatus من القسطرة وتوصيل حقنة Microfil المعدة.
  5. حقن Microfil في الشريان الأورطي حتى شغل جيد من الشرايين التاجية هو واضح (التين 1F، 3A): الشرايين ستملأ أولا، ثم في Microfil سوف "سفك" في الشعيرات الدموية كما الإحمرار النسيج مع لون Microfil. مرة واحدة على الجانب الوريدي، وطبيعة مسعور من Microfil يسبب أن يظهر في البداية على المجالات مستقل لأنه يخرج من السفن الصغيرة. تواصل ضخ Microfil حتى عمود المستمر يملأ الأوردة. وسوف ملء كامل يكون واضحا عندما Microfil مستمر داخل الأوعية، وأنها تخرج عن طريق خ.
  6. بعد تعبئة كاملة، وسرعان ما شد الخيوط التي وضعت سابقا حول بولي كلوريد الفينيل والشريان الأورطي إلى منع الطبيعة المرنة للأنسجة القلب من الضغط على Microfil من السفن.
  7. تغطية القلب مع الشاش الرطب (ينقع بالماء من علبة تشريح) لمنع تجفيف للخروج، والسماح لها الجلوس لمدة ما يقرب من 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة حتى Microfil وبلمرة. تجنب أي ضغوط خارجية على القلب خلال عملية البلمرة، مثل رفع أو تحول القلب في محاولة للحصول على وجهة نظر في وقت مبكر من السفن شغلها في الجزء الخلفي من القلب. قد يكون هذا الضغط Microfil من بعض السفن الى منطقة أكثر مرونة من القلب، مما تسبب في كسر في Microfil.
  8. إزالة القلب ومرحلة ما بعد اصلاحها في PFA 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ثم تخزين في الايثانول 70٪ في 4 درجة مئوية. والأوعية الدموية في القلب هو الآن على استعداد لتصوير μCT.

4. ممثل النتائج

والسفن التي perfused بشكل فعال من قبل Microfil لها مستمرة، غير منقطعة طوال Microfil السفن (الشكل 3A). ويمكن الحكم على مدى ملء الأوعية التاجية بواسطة العين؛ تقع epicardially عروق 18 عاما، ويمكن ملاحظتها بسهولة (الشكل 3A، رأس السهم)؛ الشرايين،والتي هي أكثر intramyocardial 18، واضحة أيضا من خلال سطح القلب (الشكل 3A، السهم). شغل شعري واضح أيضا، وأنسجة القلب لديها كثافة عالية جدا من الشعيرات الدموية، وبالتالي، عندما التعبئة الشعيرات الدموية، والأنسجة القلبية والاحمرار مع لون Microfil (الشكل 3A، نجمة). وبالتالي، فإن أي شبكات الأوعية الدموية التي فشلت في ملء يكون ملحوظا نظرا لعدم وجود Microfil (الشكل 3B، C).

انقطاعات في Microfil (العلامات النجمية في الشكل 3B) غالبا ما تظهر بسبب طبيعة مسعور من Microfil سيجعلها العقد إلى نفسه وتسبب في "فواصل" داخل الأوعية شغلها. ويمكن تخفيض هذه "الراحة" في حال المحافظة على الضغط داخل الأوعية الدموية من خلال السليم التعادل العرضية لنقاط الخروج الأوعية الدموية من القلب. يمكن أن يكون سبب الانقطاع غيرها من فقاعات الهواء داخل microfil. لمنع دخول الهواء وتأكد الغارقة تماما angiocatheter في الماء عند التبديل من وكالة اسوشييتد برس نضح paratus إلى الحقنة Microfil. إذا تم إدخال أية فقاعة هواء، ويمكن في كثير من الأحيان يمكن إزالته ببساطة من خلال الاستمرار في نضح Microfil حتى يتم دفع الفقاعة من خلال والخروج من الأوعية التاجية.

قد شبكات الأوعية الدموية لا تملأ تماما إذا تم حظر جزء من السرير الوعائي (الشكل 3B، السهم). بينما الهيبارين يحول دون تشكيل جلطات الدم، قد انسداد في بعض الأحيان لا تزال تحدث بسبب التروية الهيبارين غير مكتملة قبل بدء هذا الإجراء، أو بسبب عوامل أخرى غير معروفة. إذا انسداد يحدث، لا يوجد، على حد علمنا، لا توجد طريقة لطرد انسداد لاستكمال ملء الأوعية الدموية. ويمكن ملء ناقصة تؤدي أيضا إذا تم استخدام الضغط قليلا جدا أثناء التعبئة، كما لن Microfil يضطر إلى أسرة على جميع الأوعية الدموية والشبكات الشعرية (الشكل 3C). على العكس، يمكن أن يسبب الكثير من الضغط على الشعيرات الدموية إلى انفجار ويتسرب Microfil في الأنسجة المحيطة بها (الشكل 3D).

files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg "ALT =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. نظرة عامة على خطة نضح Microfil. (أ) قطع الشريان الأورطي، وبولي كلوريد الفينيل وعلى مستوى ما يقرب من الحجاب الحاجز. (ب) ومقنى الشريان الأبهر الصاعد مع angiocatheter. (ج) perfused العازلة توسع الأوعية عن طريق السفن، مدفوعا ضغط جهاز نضح (وليس في الصورة)، في حين أن (D) و تربط الفروع الرئيسية الثلاثة قبالة قوس الأبهر. (ه) perfused PFA 4٪ عن طريق الشرايين التاجية في حين و تربط كلا الأمامي CAVAS الوريد. (F) عن طريق حقنة، وperfused Microfil من خلال الشرايين التاجية حتى لوحظ أن تخرج من PVC.

الشكل 2
الشكل 2. جهاز نضح. وانضم اثنان من قوارير مخروطي، كل مليئة العازلة توسع الأوعية أو 4٪ PFA، وضغط من خلال أنابيب متصلة جنبيه الخاصة بهم. هذا النظام هو الضغط من خلال ضخ دليل لليرتبط بصلة، ومقياس الضغط إلى واحد من قوارير للسماح للمراقبة والمحافظة على ضغط. تمديد أنابيب صغيرة من خلال سدادات المطاط ونزولا الى السائل في كل دورق. الضغط الدخول من مضخات جنبيه السائل من كل قارورة من هذه الأنابيب الصغيرة. أنابيب ثم دمج في محبس والذي يسمح فقط لتدفق السوائل من قارورة في وقت واحد.

الشكل (3)
الشكل 3. عينة قلوب Microfilled. (أ) أن السفن التي يتم تعبئتها بشكل جيد لديها قليل (إن وجد) فواصل في Microfil، وأنسجة القلب ستكون مشوبة لون Microfil بسبب الشعيرات الدموية شغل (نجم، ومقارنة مع C). كلا الشرايين (السهم - اليسار تنازلي الشريان الأمامي) والأوردة (رأس السهم - الوريد التاجي الأيسر) واضحة من خلال سطح القلب. (ب) وقلب مع فواصل في microfil (النجمة)، فضلا عن انسداد في بعض الأوعية التي منعت هيئة التصنيع العسكري الكاملrofil الاختراق. منعت السفن لا تزال حمراء (السهم)، كما لم يتم مسح الدم من خلال عملية نضح. (ج) وقلب مع السفن التي تم شغلها بشكل غير كامل. لاحظ النسيج لم تتخذ على اللون الأصفر للMicrofil، مما يدل على Microfil لم تخترق الشعيرات الدموية. (د) حيث قلب انفجار الشعيرات الدموية أثناء التعبئة، مما تسبب في Microfil إلى تسرب الى الأنسجة المحيطة بها (السهم).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أنسجة القلب لديه الطلب مرتفع جدا الأيضية، ولذلك يحتاج الى امدادات ثابتة من المواد المغذية والأكسجين من الدم الذي ألقاه الأوعية الدموية التاجية. يمكن أن أمراض الأوعية التاجية، والتي تقلل وظيفة القلب بسبب تضيق وانسداد الأوعية، يؤدي إلى نقص الأكسجين ونقص تروية الأنسجة، ووضع المرضى المصابين في خطر لاحتشاء عضلة القلب، وضرر لا يمكن إصلاحه لعضلة القلب. وفهم أفضل للحالة المريضة من هذه السفن هو ضروري، والحاسمة لقدرتنا على دراسة الأوعية التاجية هو تصور من الأوعية الدموية. هنا، نقدم طريقة لإعداد الأوعية الدموية التاجية الفئران لتصوير المجراة سابقا عن طريق ملء الأوعية الدموية بمادة ظليل للأشعة. تم تصميمها خصيصا هذا البروتوكول لضمان ملء كاملة، وتصور في وقت لاحق، من جميع الأوعية التاجية بما في ذلك الشعيرات الدموية.

لضمان تعبئة كاملة من جميع الشعيرات الدموية، وملء آجايجب أن يتم حقن تي، Microfil، في نظام مغلق جزئيا من شأنها أن تجبر Microfil إلى أصغر والأوعية مقاومة أعلى داخل الشبكة الأوعية الدموية. لإنشاء هذا الإغلاق الجزئي ضمن لدينا في الجسم الحي تعبئة النظام، ونحن ligate أكبر ثلاثة شرايين مقاومة منخفضة المتفرعة من قوس الأبهر. في حين أن هذا لا يستبعد كل المحتملة الأخرى "التسرب" نقطة، والسفن الباقية (أساسا الشرايين الوربية) صغيرة بما فيه الكفاية على أن أي ضغط خسر خلالهم لا تتدخل في شغل كامل للنظام الأوعية الدموية التاجية. مرة واحدة في Microfil وperfused جميع السفن في القلب، والطبيعة الفطرية مرونة من أنسجة القلب والأوعية الدموية ضغط على Microfil من بعض السفن. لمنع هذه الخسارة من Microfil، ونحن ligate جميع نقاط الخروج واسعة ويمكن الوصول إليها، وهما على حد سواء متفوقة الوريد الأجوف، والوريد الأجوف الخلفي، والشريان الأورطي، وبعد أن يتم perfused تماما الأوعية الدموية التاجية. بهذه الطريقة، هو الضغط مaintained في قلب حتى Microfil polymerizes، والسماح للMicrofil ليتطابق مع هيكل السفينة تحت ضغط الدم الطبيعي الفسيولوجية.

بدلا من ذلك، إذا كان غير مطلوب التصور من الشعيرات الدموية، فإنه من الممكن أيضا لملء سوى سرير الشرياني أو الوريدي فقط في الأوعية الدموية. ويمكن خلط إصدارات أكثر لزوجة من Microfil باستخدام مادة التخفيف اللزوجة العالية (متوفر من FlowTech). وسائل الإرواء أكثر لزوجة غير قادر على التغلغل في الشعيرات الدموية، وبالتالي يسمح التصور من الشرايين فقط، أو أوردة فقط إذا perfused من الجانب الوريدي. وبالإضافة إلى ذلك، قدم بروتوكول هنا يمكن بسهولة أن تتكيف مع الأنواع الأخرى أو الفئران غير البالغين. توسيع نطاق هذا الإجراء لتتناسب بشكل مناسب لحجم الحيوان يتطلب ببساطة أن القسطرة وأنابيب التروية والحجم المناسب لالأبهر الحيوان وذلك للحد من تسرب ومنع التمدد أو كسر. كميات من السوائل حقن (أي الهيبارين،ويجب أيضا بوكل المشبعة، وعلى Microfil) يمكن تحجيمها بشكل مناسب.

صممت خصيصا لدينا بروتوكول للحقن من Microfil والتصوير بواسطة μCT، ومع ذلك، يمكن بسهولة أن يتم تكييفها لغيرها من وكلاء تعبئة، إما لتحليل μCT، أو غيرها من تقنيات التصوير خارج الحي. ويمكن غرست عندما تبحث عن الحشو متوافق μCT، وهناك خيارات عدة من الأصباغ ظليل للأشعة، كما العديد من المواد المستخدمة لتعبئة ودراسة الأوعية الدموية عن طريق طرق التصوير الأخرى (مثل الاكريليك) مع المواد الإذاعية مبهمة، مثل صبغة الرصاص 9 أو حلا الأوزميوم 3. بغض النظر عن عامل تعبئة استخدامها، μCT التصوير يوفر ميزة التي يمكن بناؤها النتائج في نموذج 3D لتوفير قياسات الأوعية الدموية، فضلا عن معلومات حول الهيكلية في نمط المتفرعة من الشريان التاجي والأوعية المليئة 6،7،14،19. وبالإضافة إلى ذلك، والتصوير من قبل μCT يحافظ على الأنسجة المحيطة بها، وبالتالي السماح لمزيدalyses بعد الفحص. وبالتالي، يمكن معالجة قلوب تملأ وفحصها للتحليل النسيجي، ويمكن أن تكون محاذاة المقاطع ملطخة عن علامات المختلفة مع البيانات μCT لربط هوية شرياني / وريدي، ووجود المعاطف العضلات الملساء، أو مؤشرات إضافية النسيجية.

آخر مشترك تقنيات التصوير الوعائي تتطلب أيضا ملء الأوعية الدموية، ويمكن بسهولة أن تتكيف لدينا بروتوكول للperfusing في الشرايين التاجية مع أي من هذه العوامل الأخرى تعبئة. المجهر الإلكتروني (SEM) يتطلب تعبئة الأوعية ومن ثم حل الأنسجة اللينة بعيدا عن المدلى بها الأوعية الدموية التي أنشئت في عملية تسمى الصب التآكل. من أجل الحفاظ على شكل سفينة من دون دعم من النسيج الرخو المحيطة بها، ويجب على وكيل تعبئة تكون قوية وغير هش-: غالبا ما يكون راتنج الأكريليك (على سبيل المثال Mercox، وباتسون) 3،20،21. في حين يوفر SEM قرارات مسح متفوقة إلى أن التصوير μCT 22، التي اشتركت في تآكلجي إجراء يدمر الأنسجة، ومنع أي تحليل الأنسجة الإضافية. طريقة أخرى يمكن من التصوير الحي السابقين من الأوعية الدموية التاجية، والتصوير المقطعي الإسقاط الضوئية (الأراضي الفلسطينية المحتلة)، والكشف عن الضوء المرئي أو بالقرب مرئية، وبالتالي يسمح للكشف عن اشارات فلوري، بالإضافة إلى مولد اللون يترسب مثل راسب الأرجواني التي تنتجها الفوسفاتيز القلوية تحويل BCIP / NBT (5-برومو-4-كلورو-3-indolyl phosphate/4-nitro الزرقاء tetrazolium) 23-25. تصور من السفن، وبالتالي، فانه يمكن تحقيق إما عن طريق تعبئة بمادة فلوري (على سبيل المثال PU4ii: أ راتنج من البولي يوريثين أو فلوريسئين غرست ديكستران 26)، أو من خلال المنظمات غير تعبئة، طرق، مثل كل جبل مناعي إما عن طريق مضان أو مولد اللون راسب النسيجية (على سبيل المثال BCIP / NBT) 23. يمكن أن تختار التصوير تحقيق قرارات أفضل بقليل من μCT (إلى حوالي 1 ميكرون)، ومع ذلك، لملء على حد سواء وعلى immunodeteيجب أن تكون أساليب ction الأنسجة المحيطة الناعمة تطهيرها كيميائيا، والتي قد تعطل بعض مولدات المضادات للتحليل النسيجي بعد المسح الضوئي.

وهناك أيضا العديد من الطرق لتصوير الأوعية الدموية التاجية التي لا تتطلب ملء الأوعية الدموية أو مناعي، وكما لا يمكن أن يؤديها من هذا القبيل في الجسم الحي. أسلوب واحد، على النقيض من محسن الموجات فوق الصوتية عالية الدقة (CEHRUS)، ويستخدم microbubbles الغاز تملأ كعامل النقيض. حقن هذه microbubbles في مجرى الدم يسمح لرؤية تدفق الدم مع قياسات تدفق في الوقت الحقيقي وصولا الى المستوى الشعري، ولكنها لا تقدم وجهة نظر 3D من السفن المصورة 2،27-31. وقد مددت طريقة أخرى، كما تم تصوير الأوعية الدموية الرنين المغناطيسي (MRA) المستخدمة في السفن صورة التاجي 32-34، والتطورات الحديثة في MRA قدرات التصوير من أجل الحصول على الوقت الحقيقي لقياس تدفق الدم 35،36. في حين يمكن اعادة بناء MRA إنتاج 3D لهاءويقتصر حاليا ssels المصورة، وهذا القرار من MRA إلى حوالي 100 ميكرون، وفشل بالتالي في تحديد السفن الصغيرة (الشعيرات الدموية، الشرايين والأوردة).

منذ لا يمكن أن يؤديها كل من CEHRUS ومرا على الحيوانات الحية، وأنها توفر ميزة مرارا وغير جراحية لمراقبة تدفق الدم في الأوعية الدموية والتنمية. ومع ذلك، فإن قرار منخفضة نسبيا من مرا وعدم وجود قدرات 3D من CEHRUS يمنع التصوير في شبكة الشرايين التاجية ككل. وهكذا، فإن التصوير المجراة سابقا والتي تتطلب تقنيات الأوعية الدموية وكلاء تعبئة أو مناعي مهمة للحصول على معلومات عالية القرار 3D للنظام الأوعية الدموية التاجية، في حين أن الجسم الحي في تقنيات توفير معلومات قيمة حول الأداء الوظيفي للشبكة الأوعية الدموية (أي تدفق البيانات) على مر الزمن . تجمع في الجسم الحي وقت تحليل مسار نقطة مع نهاية التصوير فيفو السابقين ويوفر نظام قوي لدراسة الأوعية الدموية التاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد تم التعامل مع الفئران مع الأساليب التي وافق عليها رعاية الحيوانات المؤسسية واللجنة الاستفادة من جامعة واشنطن وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية الصادرة عن المعاهد الوطنية الأميركية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85-23، تنقيح عام 1996).

Acknowledgments

نشكر الدكتور كيلي ستيفنز للمحاكمات الأولى للبروتوكول، والدكتور مايكل سيمونز، والدكتور Hauch كيب، وأعضاء من كل من المختبرات من أجل مناقشة عامة.

هذا العمل هو الدعم من خلال المنح والمعاهد الوطنية للصحة HL087513 HL094374 P01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringes BD Biosciences BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles BD Biosciences BD-309306
2" x 2" Gauze pads Med101store.com SKU 2208
24G ¾" Angiocath IV catheter BD Biosciences BD-381112
26G ½"gauge needles BD Biosciences BD-305111
Adenosine Sigma-Aldrich A9251 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps Fine Science Tools 11052-10
Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile Cardinal Health C15055-006
Curved Surgical Scissors Fine Science Tools 14085-09
Dissecting stereoscope and light source Nikon Instruments NA NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches Cole-Parmer YO-10915-12 Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps Aesculap FD281R Need two
Heparin, 5000 U/ml stock APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10 1:100 dilution in water
KCl Fisher Scientific P217 Saturated solution in H2O
Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil FlowTech MV-122 (yellow). Other color options are also available. Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk Harvard Apparatus 723287
Papaverine American Regent Inc. NDC 0517-4010-01 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus See figure 2
Spring Scissors Fine Science Tools 15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock Lloyd, Inc. NADA #139-236 Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
  2. Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
  3. Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
  4. Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
  5. Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
  6. Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
  7. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
  8. Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
  9. Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
  10. Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
  11. Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
  12. Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
  13. Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
  14. Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
  15. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
  16. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  17. Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
  18. Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
  19. Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
  20. Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
  21. Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
  22. Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
  23. Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
  24. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Protoc. 586-594 (2011).
  25. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
  26. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
  27. Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
  28. Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
  29. Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
  30. Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
  31. Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  32. Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
  33. Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
  34. Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
  35. Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
  36. Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. 254-441 (2010).
إلى الوراء الإرواء وملء الأوعية الدموية التاجية الفأر كما التحضير للتصوير المقطعي بالكمبيوتر مايكرو
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).More

Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter