Summary
Abstract
الاختلافات الفردية في الحالة المناعية تحديد الردود على العدوى والمساهمة في شدة المرض والنتيجة. ويرتبط الشيخوخة مع زيادة الحساسية للالتهابات الفيروسية والبكتيرية وانخفاض القدرة على الاستجابة للقاحات مع انخفاض الموثقة توثيقا جيدا في الخلطية فضلا عن الخلية التي تتوسط فيها 1،2 الاستجابات المناعية. لقد قمنا بتقييم مؤخرا من آثار الشيخوخة على الرقم مثل مستقبلات (TLRs)، والمكونات الرئيسية للنظام المناعة الفطرية التي تكشف عن العدوى الميكروبية والزناد دفاع المضيف مضادات الميكروبات ردود 3. في لفيف كبير من الجهات المانحة البشرية الصحية، ونحن أظهرت أن حيدات الدم المحيطي من كبار السن قد انخفضت التعبير وظيفة TLRs معينة (4) ومستويات مماثلة TLR انخفاض والاستجابات يشير في الخلايا الجذعية (DCS)، مستضد تقديم الخلايا التي تقوم بدور محوري في الربط بين الحصانة الفطرية والتكيفية 5. لقد أظهرنا dysregulation من TLR3 في الضامة 1د انخفاض إنتاج الإنترفيرون من قبل البلدان النامية من الجهات المانحة المسنين في استجابة للإصابة بعدوى فيروس غرب النيل 6،7.
قصوى في فهمنا للتشيخ مناعي والتدخل العلاجي هو فهم مفصل لأنواع معينة من الخلايا الاستجابة وآلية (ق) من نقل الإشارة. لقد تقدمت الدراسات التقليدية من الاستجابات المناعية من خلال التصوير من الخلايا الأولية وعلامات الخلية المسح من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية أو طخة مناعية فهمنا بشكل كبير، ومع ذلك، وتقتصر هذه الدراسات بشكل عام من الناحية الفنية من خلال حجم عينة صغيرة المتاحة من المرضى وعدم القدرة على إجراء تقنيات مختبرية معقدة على عدة الإنسان العينات. ImageStream يجمع كمية التدفق الخلوي في وقت واحد مع عالية الدقة التصوير الرقمي، وبالتالي يسهل تحقيق في السكان الخلية متعددة متزامنة لالتقاط كفاءة قابلية المريض. نحن هنا لشرح استخدام ImageStream في البلدان النامية لتقييم TLR7 / 8تفعيل بوساطة الزيادات في الفسفرة وإزفاء النووية عامل النسخ مفتاح، NF-κB، الذي يبدأ النسخ من الجينات العديدة التي تعتبر بالغة الأهمية بالنسبة الاستجابات المناعية 8. باستخدام هذه التكنولوجيا، ونحن كما أظهرت مؤخرا تغيير غير المعترف بها من قبل من TLR5 إشارات والمسار NF-κB في حيدات من أقدم الجهات المانحة التي قد تسهم في الاستجابة المناعية المعدلة في الشيخوخة 9.
Protocol
1. العزلة وتنشيط الخلايا المناعية
- الحصول على 10-50 مل من الدم heparinized متطوعين أصحاء بعد الموافقة المسبقة عن كتابي في إطار المبادئ التوجيهية للمجلس مراجعة المؤسسية المحلية. يجب أن لدراسات الشيخوخة أو المرض يمكن المرضية والاستبعاد ومعايير الاشتمال لكل متطوع أو المريض تحدد بشكل واضح.
- عزل خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) باستخدام أنابيب لجنة مناهضة التعذيب أو Ficoll Paque زائد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (شركة جنرال الكتريك للرعاية الصحية، ونيو جيرسي) وإجراء التجارب في يوم من العزلة 7 (الكواشف، الجدول 1).
- احتضان PBMCs (3 × 10 6 / أنبوب) في 1.5 مل أنابيب في المتوسط 0.6 لتر وحده أو مع حفز يغاندس TLR أو وكلاء تفعيل أخرى، مثل يجند TLR7 / 8 R848 (0.6 مل المتوسط زائد 0،6 ميكرولتر من 10 ملي TLR7 / 8 يجند R848، تركيز نهائي 10 ميكرومتر) في 37 درجة مئوية ل10-60 دقيقة (InvivoGen، كاليفورنيا) 9.
2. مختبرنحمل من خلايا
- تسمية نسب الخلية وعلامات أخرى على سطح الخلية الحية الايقاف باستخدام الاجسام المضادة fluorescently مترافق. ملصق 3 × 10 6 PBMCs لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في 100 ميكروليتر من PBS FBS 2٪ / في أنبوب 1،5 مل إيبندورف مع مزيج من الاجسام المضادة المحددة لسطح الأنساب الوحيدات أو العاصمة (الجدول 2). ويمكن تحديد التخفيفات الضد الأمثل في التجارب الأولية والعينات وينبغي أن تتم معالجتها على دفعات لتقليل الكثير إلى الكثير الاختلاف. بالنسبة لمخزون الجسم المضاد بائع من 0.1 ملغ / مل استخدام 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة (1:20 تخفيف). استخدام أنبوب منفصل من الخلايا المسمى مع واحد فقط المتقارن لون واحد لإعداد القنوات فلوري على الصك.
- بعد وضع العلامات السطحية، وإصلاح الخلايا في 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT. لتخزين حتى وقت التحليل، وخلايا للطرد المركزي في 500 XG والخلايا resuspend في تجميد عازلة (90٪ FBS التي تحتوي على 10٪ DMSO) في -80 درجة مئوية حتى يوم الفحص.
- لتقييم عملية دفعات، سو الخلايا غير المعالجة، وحفزت من مجموعة من المانحين معا للحد من التقلبات. في يوم من التحليل، وذوبان الخلايا بسرعة في درجة حرارة 37 م حمام الماء، الطرد المركزي في ز 500x لإزالة تجميد عازلة.
- إلى permeabilize الخلايا للكشف عن السيتوكينات داخل الخلايا أو علامات أخرى، تعليق خلية resuspend في 100 ميكروليتر العازلة بيرم / غسيل دينار بحريني دينار بحريني (العلوم الحيوية، ونيو جيرسي). تسمية الخلايا المكونات مع الإشارة على سبيل المثال، 1:20 التخفيف من الأجسام المضادة أرنب (P65) المضادة للNF-κB (تركيز نهائي 10 ميكروغرام / مل، وسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، كاليفورنيا) لمدة 20 دقيقة على RT، الطرد المركزي في 500 XG، وطاف نضح خلايا resuspend في 100 دينار بحريني بيرم ميكروليتر / غسل العازلة التي تحتوي على 1:250 تخفيف المضادة للأرنب الماعز مفتش-Alexa647 (إينفيتروجن، كاليفورنيا)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
- مباشرة قبل التصوير، ملون مباين نوى مع دابي (0.2 ميكروغرام / لتر، إينفيتروجن، CA) أو propidium يوديد (PI، و 20 نانوغرام / مل، إينفيتروجن، كاليفورنيا).
3. ImageStream التحليل
- إجراء التصوير بواسطة ImageStream على عينات مجمعة في حزم للحد من التباين بين العينات البشرية. وكانت وسيلة لضبط قوة الليزر على النحو التالي: 200 ميغاواط عن 488 نانومتر، 10 ميغاواط عن 658 نانومتر و 250 ميغاواط ل405 نانومتر.
- لتحليل ملفات البيانات (الشكل 1)، أولا، بوابة على الأحداث مع كثافة PI طبيعية وارتفاع نسبة الارتفاع PI (عرض: نسبة الارتفاع) للتمييز بين الخلايا واحد (R1) من الحطام (الأقل كثافة PI) أو أحداث متعددة الخلايا ( ارتفاع وانخفاض كثافة PI نسبة الارتفاع). حيدات هي ضمن بوابة لخلايا CD14 إيجابي. mDCs من خلال بوابة للخلايا التي هي عالية ومنخفضة لCD11c لCD4 (R2)، وانخفاض أيضا عن علامات-1 لين (R3).
- استخدام أفكار البرامج (Amnis، WA) لتوفير تدبيرا فعالا الكمي لدرجة من تفعيل كل خلية. تحديد التشابه (أو شارك في التعريب) من عامل النسخ حشوية NF-κB النووية مع صبغ PI للإشارة إلى إزفاء داخل النواة (R4). وهناك ارتباط كبير من locali NF-κB/PIوينعكس الأسلحة سواء في درجة تشابه عالية ويدل على درجة من التنشيط 10.
- مقارنة نسب التشابه بين الجماعات المختلفة أو علاج المريض السكان تشير إلى كفاءة وظيفية النسبي للخلايا. تحديد البيانات من خلال مقارنة بين عينات إحصائية من القيم المطلقة أو الاختلافات أضعاف. استخدام أفكار البرامج لعرض الصور من الخلايا من قطاعات رئيسية من المدرج الاحصائي عدد السكان (الشكل 2).
4. ممثل النتائج
وكميا نحن مسارات إشارات استجابة ليجند نموذج الفيروسية من خلال تحفيز PBMCs مع يجند TLR7 / 8، R848 (الشكل 1). جمعنا كل الصور توطين الخلوية والإحصاءات السكانية في مجموعات لدينا عينة (الشكل 2). ImageStream يسمح لنا فرعية خلية بوابة مباشرة من PBMCs والاستجابات الخلية صورة من سكان الخلية المغلقة، ولكن لم يتم فرزها. هنا نحن كميا تأثير TLR قignaling على توطين النووية من NF-κB (P65) في Lin1، CD4 خافت، CD11c + النخاعي البلدان النامية (mDCs). في الأساس، لاحظنا على نسبة عالية من الخلايا unstimulated مع عامل النسخ NF-κB (P65) في السيتوبلازم. بعد التحفيز، الخلايا المعالجة يكون على درجة التشابه أعلى بكثير من NF-B (P65) مع PI صمة عار النووية، مشيرا إلى أن NF-κB (P65) translocated الى نواة بعد التحفيز (درجات التشابه وسيطة هي 1.52 و 3.01، على التوالي، الشكل. 2). وأشارت نتائج مماثلة في حيدات، TLR5 حفز 9.
الشكل 1. تلطيخ والاستراتيجية المحاصرة لتحديد الآثار المترتبة على التحفيز على mDCs الإنسان. عامل النسخ NF-κB ينظم التعبير عن العديد من الجينات جهاز المناعة. هذه الدراسة تقيس توطين النووية من NF-κB (P65) في موضوع mDCs من ممثل واحد بعد TLR7 / 8 ليغا الثانية والتحفيز. في تركيز وقد تم تحديد الخلايا واحد من قبل المعزولة في الأحداث الإيجابية PI مع ارتفاع نسب النووية (R1). وكانت mDCs (Lin1، CD4dim، CD11c +) بوابات في R3. يتم رسم توطين النووية من NF-κB (P65) في R4. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. . إزفاء من NF-κB في mDCs بعد التحفيز ويظهر إزفاء من NF-κB (P65) في نواة بعد التحفيز (R4) في السكان من mDCs غير المعالجة، وحفزت، ودرجة التشابه وسيطة 1.52 في العينة غير المعالجة و 3،01 في العينة حفز (A). الصور الرقمية التي تم جمعها في وقت واحد من السكان خلية غير المعالجة أو حفز R848-إظهار الخلايا ممثل وشدة NF-B translocated إلى نواة الخلية (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة في استخدام ImageStream للدراسات متعدية هي اختيار مجموعات المقارنة ذات الصلة، والتحسين والتحقق من نوعية الأجسام المضادة. والفروق بين الجماعات موضوع في الهدف المسمى يكون واضحا من خلال رسوم بيانية وصور الخلية. بالاشتراك مع تحليل دقيق للتغيرات في مستقبلات ذات الصلة، ومسارات إشارات، وهذه البيانات تقدم معلومات قيمة حول الآليات التي تكمن وراء dysregulation المناعي في الأفواج المتخصصة. وستقتصر هذه التقنية التي توفر من الاجسام المضادة المحددة للتقارب كاف للأهداف ذات الصلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الصك هو الأكثر ملاءمة لمنشأة متعددة المستخدمين وبرامج التحليل يتطلب بعض الرعاية لإتقان.
هذه التقنية هي تقنية قوية لتحقيقات متعدية من الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد سمح التقدم في تسلسل الجينوم والتكنولوجيا مجموعة تحديد المتغيرات المتورطين في مأي أمراض، ولكن نادرا تحديد آلية العمل من الجينات المرشحة. دراستنا توفر نموذجا للتحقيقات متعدية في كل موضوع على حدة، مثل النووي إلى نسبة حشوية من NF-κB بعد التحفيز. من عينة صغيرة من الدم، ويمكننا تحديد الفرق تجهيز أو يشير بطريقة محددة النسب في موضوع الخلايا الخاصة. باستخدام هذا الأسلوب، ونحن كميا الاستجابات الخلوية في حيدات من لفيف كبير من المواضيع الشباب والمسنين والتعديلات تظاهروا في خلية يشير في الشيخوخة 9. ويمكن تطبيق ImageStream على نطاق أوسع لتسليط الضوء على الآليات الرئيسية في الخلايا في العديد من التحقيقات مثل العلاج المستجيبين وغير المستجيبين، أو لموضوع فردي قبل وبعد العلاج، أو أثناء مضيئة ومغفرة. مع بعض التعديلات وفيرة ممكن للاختيار من مجموعة الموضوع قيد الدراسة، أنواع الخلايا، والآليات الخلوية للتحقيق، والتطبيقات المستقبلية من ImageStream عديدة وشولد السماح تقدما كبيرا في مجالات عديدة متعدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (N01 HHSN272201100019C، U19 089992 لمنظمة العفو الدولية، وبرنامج NCRR / GCRC M01-RR00125). الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المالية واشكر الدكتور مارك Shlomchik، مدير مرفق خلية ييل الأساسية فارز.
References
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S.
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
