Summary
Abstract
Individuelle variasjoner i immunstatus bestemme tiltak mot smitte og bidra til sykdommens alvorlighetsgrad og utfall. Aldring er assosiert med en økt mottakelighet for virus og bakterieinfeksjoner og redusert respons på vaksiner med en veldokumentert nedgang i humoral samt celle-mediert immunrespons 1,2. Vi har nylig vurdert effekten av aldring på Toll-lignende reseptorer (TLRs), viktige komponenter i det medfødte immunsystemet som gjenkjenner mikrobiell infeksjon og trigger antimikrobielle vert forsvar svar 3. I en stor kohort av friske mennesker givere, viste vi at perifere blod monocytter fra de eldre har redusert uttrykk og funksjon av visse TLRs 4 og lignende redusert TLR nivåer og signalering svar i dendrittiske celler (DCS), antigen-presentasjon celler som er sentrale i sammenhengen mellom medfødt og adaptiv immunitet 5. Vi har vist feilregulering av TLR3 i makrofager end lavere produksjon av IFN av utviklingsland fra eldre donorer som respons på infeksjon med West Nile-viruset 6,7.
Paramount til vår forståelse av immunosenescence og terapeutisk intervensjon er en detaljert forståelse av spesifikke celletyper svare og mekanismen (e) av signaltransduksjon. Tradisjonelle studier av immunreaksjoner gjennom avbildning av primære celler og oppmåling celle markører ved FACS eller immunoblot har utvidet vår forståelse betydelig, men disse studiene er generelt begrenset teknisk av den lille prøvevolum tilgjengelig fra pasienter og manglende evne til å gjennomføre komplekse laboratorieteknikker på flere humane prøver. ImageStream kombinerer kvantitativ flowcytometri med samtidig høy oppløsning digital bildebehandling og dermed forenkler etterforskning i flere celle populasjoner møtereferat for en effektiv fangst av pasientens følsomhet. Her kan vi demonstrere bruk av ImageStream i utviklingsland for å vurdere TLR7 / 8aktivering-mediert økning i fosforylering og kjernefysisk translokasjon av en nøkkel transkripsjonsfaktor, NF-κB, som initierer transkripsjon av mange gener som er kritiske for immunreaksjoner 8. Ved hjelp av denne teknologien, har vi også nylig demonstrert en tidligere ikke endring av TLR5 signalering og NF-κB spredningsveier i monocytter fra eldre givere som kan bidra til endret immunrespons i aldring 9.
Protocol
1. Isolering og stimulering av immunceller
- Skaff 10-50 ml heparinisert blod fra friske frivillige etter skriftlig informert samtykke i henhold til retningslinjene i den lokale Institutional Review Board. For studier av aldring eller sykdom patogenese, utestenging og inklusjonskriteriene for hver frivillig eller pasient må eksplisitt bestemt.
- Isoler humane perifere mononukleære blodceller (PBMCs) med CPT-rør eller Ficoll-Paque Plus i henhold til produsentens instruksjoner (GE Healthcare, NJ) og utføre eksperimenter på den dagen isolasjon 7 (reagenser, tabell 1).
- Inkuber PBMCs (3 x 10 6 / tube) i 1,5 ml rør i 0,6 ml medium alene eller stimulert med TLR ligander eller andre aktiverende midler, f.eks den TLR7 / 8 ligand R848 (0,6 ml medium pluss 0,6 mL av 10 mM TLR7 / 8 ligand R848, endelig konsentrasjon 10 mm) ved 37 ° C for 10-60 min (InvivoGen, CA) 9.
2. LabEling av celler
- Etikett celle avstamning og andre overflate markører på live cellesuspensjoner hjelp fluorescently-konjugerte antistoffer. Label 3 x 10 6 PBMCs i 20 min ved 4 ° C i 100 mL PBS / 2% FBS i et 1,5 ml Eppendorf rør med en cocktail av overflaten antistoffer spesifikke for monocytter eller DC linjene (tabell 2). Optimale antistoff fortynninger kan bestemmes i gangsetting og prøver skal behandles i bunker for å minimere lot til lot variasjon. For leverandøren antistoff lager på 0,1 mg / ml bruke 5 mL av antistoff (1:20 fortynning). Bruk en egen tube av celler merket med bare én farge konjugat for å sette opp de fluoriserende kanaler på instrumentet.
- Etter overflate merking, fikse celler i 4% PFA / PBS for 10 min ved RT. For lagring inntil tidspunktet for analyse, sentrifuger cellene ved 500 xg og Resuspender celler i frysing buffer (90% FBS inneholder 10% DMSO) ved -80 ° C til den dagen analysen.
- For vurdering, prosess batcher of ubehandlet og stimulert celler fra en gruppe givere sammen for å redusere variabiliteten. På dagen for analysen, tine cellene raskt i 37 ° C vannbad, sentrifuger ved 500x g å fjerne frysing buffer.
- For å permeabilize celler for påvisning av intracellulære cytokiner eller andre markører, Resuspender cellesuspensjoner i 100 mL BD Perm / vaskebuffer (BD Biosciences, NJ). Etikett for intracellulære signalmolekyler komponenter med f.eks, 1:20 fortynning av kanin anti-NF-κB (p65) antistoff (endelig konsentrasjon 10 mg / ml, Santacruz Bioteknologi, CA) for 20 min ved RT, sentrifuger ved 500 xg, aspirer supernatanten og Resuspender celler i 100 mL BD Perm / Vaskebuffer inneholder 1:250 fortynning av geit anti-kanin IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) og inkuberes i 20 min ved RT.
- Umiddelbart før bildebehandling, counterstain atomkjerner med DAPI (0,2 mikrogram / ml, Invitrogen, CA) eller propidium jodid (PI, 20 ng / ml, Invitrogen, CA).
3. ImageStream Analyse
- Gjennomføre imaging ved ImageStream på grupperte prøver å redusere variasjonen mellom humane prøver. Instrument innstillinger for strøm av lasere var som følger: 200 mW for 488 nm, 10 MW for 658 nm og 250 MW for 405 nm.
- Å analysere data filer (Fig. 1), første, gate på hendelser med normal PI intensitet og høy PI størrelsesforhold (bredde: høyde-forhold) for å skille enkeltceller (R1) fra rusk (lav PI intensitet) eller flercellede hendelser ( høy PI intensitet og lav sideforhold). Monocytter er innenfor en gate for CD14 positive celler. mDCs er innenfor en gate for celler som er høy for CD11c og lavt etter CD4 (R2) og også lav for Lin-1 markører (R3).
- Bruk IDEAS programvare (Amnis, WA) for å gi en effektiv kvantitativt mål på graden av aktivering av hver celle. Bestem likheten (eller samlokalisering) av cytoplasmatisk transkripsjonsfaktor NF-κB med kjernefysisk fargestoff PI å indikere translokasjon inn i kjernen (R4). En høy korrelasjon av NF-κB/PI localization gjenspeiles i en høy likheten score og angir graden av aktivering 10.
- Sammenlign Likhetene forholdstall mellom ulike behandlingsgruppene eller pasientgrupper som indikerer relativ funksjonell effektivitet av cellene. Kvantifisere data mellom prøver gjennom statistisk sammenligning av absolutte verdier eller fold forskjeller. Bruk IDEAS programvare for å vise bilder av celler fra sentrale deler av befolkningen histogrammer (Fig. 2).
4. Representative Resultater
Vi har kvantifisert signalveier som svar på en modell viral ligand ved å stimulere PBMCs med TLR7 / 8 ligand, R848 (Fig. 1). Vi samlet både cellulær lokalisering bilder og befolkningsstatistikk i våre eksempler grupper (Fig. 2). ImageStream tillater oss å gate celle undergrupper direkte fra PBMCs og bilde celle responser fra gated, men usorterte celle populasjoner. Her har vi kvantifisert effekten av TLR signaling på kjernefysisk lokalisering av NF-κB (p65) i Lin1-, CD4 dim, CD11c + myeloid DCS (mDCs). Ved studiestart, observerte vi en høy andel av unstimulated celler med transkripsjonsfaktor NF-κB (p65) i cytoplasma. Etter stimulering, behandlede celler har en betydelig høyere likhet score på NF-B (p65) med kjernefysiske beis PI, som indikerer at NF-κB (p65) translocated inn i kjernen etter stimulering (median likhet score er 1,52 og 3,01, henholdsvis, fig. 2). Lignende resultater er registrert i TLR5-stimulerte monocytter 9.
Figur 1. Farging og Gating strategi for å kvantifisere effektene av stimulering på menneskelige mDCs. NF-κB transkripsjonsfaktor regulerer uttrykk av tallrike immunsystem gener. Denne studien måler den kjernefysiske lokalisering av NF-κB (p65) i mDCs fra en representant gjenstand etter TLR7 / 8 liga nd stimulering. I fokus enkeltceller ble identifisert ved gating på PI positive hendelser med høye kjernefysiske størrelsesforhold (R1). mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +) var inngjerdet i R3. Nuclear lokalisering av NF-κB (p65) er plottet i R4. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. . Translokasjon av NF-κB i mDCs etter stimulering translokasjon av NF-κB (p65) i cellekjernen etter stimulering (R4) er avbildet i populasjoner av ubehandlede og stimulert mDCs, median likheten scorer er 1,52 i ubehandlet prøven og 3,01 i stimulert utvalget (A). Digitale bilder fanget samtidig av de ubehandlede eller R848-stimulerte celle populasjoner viser representative celler og intensiteten av NF-B translocated inn i cellekjernen (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trinn i bruk av ImageStream for translasjonsforskning studier er utvalget av aktuelle sammenligningsgruppene og optimalisering og validering av antistoffspesifisitet. Forskjeller mellom faggruppene i merket målet vil være lett synlig gjennom histogrammer og celle bilder. I kombinasjon med en grundig analyse av endringer i relevante reseptorer og signalveier, vil disse dataene gi verdifull innsikt i mekanismer som ligger til grunn immun feilregulering i spesialiserte kohorter. Teknikken vil være begrenset av tilgjengeligheten av spesifikke antistoffer av tilstrekkelig affinitet for relevante mål. I tillegg er instrumentet mest egnet for en multi-bruker anlegget og analyse programvare krever litt omsorg for å mestre.
Denne teknologien er en kraftfull teknikk for translasjonsforskning undersøkelser av menneskelige sykdommer. Fremskritt innen genom sekvensering og array-teknologi har tillatt identifisering av varianter innblandet i mnoen sykdommer, men sjelden identifiserer virkningsmekanismen av nominert genet. Våre undersøkelser gir en blåkopi for translasjonsforskning undersøkelser i enkelte fag slik som kjernefysisk til cytoplasma ratio på NF-κB etter stimulering. Fra en liten blodprøve, kan vi identifisere differensial behandler eller signal i en ætt bestemt måte i et emne egne celler. Ved hjelp av denne metoden, har vi kvantifisert cellulære responser i monocytter i en stor kohort av unge og eldre fag og demonstrerte endringer i celle signalisering i aldring 9. ImageStream kan brukes mer generelt for å markere viktige mekanismer i cellene i mange undersøkelser som terapi respondere og ikke-respondere, eller for en enkelt fag før og etter behandling, eller under flare og remisjon. Med rikelig modifikasjoner mulige for valg av faggrupper under studien og celletyper, og cellulære mekanismer for å undersøke, de fremtidige anvendelser av ImageStream er mange og should tillate betydelige fremskritt i mange translasjonelle områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089 992, og den NCRR / GCRC Program M01-RR00125). Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser og takke Dr. Mark Shlomchik, direktør for Yale Cell sorter Kjerne Facility.
References
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S.
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
