Summary
Abstract
면역 상태에서 개별 유사 감염에 반응을 파악하고 질병의 심각도 및 결과에 기여. 고령화는 바이러스성 및 세균성 감염으로 증가 자화율와 연관된와 체액에 잘 문서화된 감소뿐만 아니라 세포 매개 면역 반응의 1,2와 백신에 반응을 감소합니다. 우리는 최근에 수신자와 같은 수용체 (TLRs), 미생물 감염 및 트리거 항균 호스트 방어 반응 3 감지 타고난 면역 시스템의 주요 구성 요소에 노화의 영향을 평가했습니다. 건강한 인간 기증자의 큰 일대에서, 우리는 노인에서 해당 말초 혈액 monocytes 표현 및 특정 TLRs 4와 돌기 세포에서 유사한 감소 TLR 수준 및 신호 응답 (DC가)의 기능을 감소 보여줬에 필수적입니다 세포를 항원 제시 타고난 및 적응 면역 5 사이의 결합. 우리는 macrophages에 TLR3의 dysregulation을 보였습니다웨스트 나일 바이러스 6,7와 감염에 대한 반응으로 노인 기증자로부터 DC가에 의한 IFN의 D 낮은 생산.
immunosenescence 우리의 이해와 치료 개입 파라마운트 응답 특정 세포 유형에 대한 자세한 이해와 신호 전달의 메커니즘 (들)입니다. FACS 또는 immunoblot에 의해 일차 전지 및 측량 세포 마커 영상을 통해 면역 반응의 전통적인 연구 결과 그러나 이러한 연구는 일반적으로 환자에서 제공하는 작은 샘플 볼륨과 여러에 복잡한 실험실 기술을 수행하는 무능력에 의해 기술적으로 제한되며, 크게 우리의 이해를 전진했습니다 인간의 샘플. ImageStream 동시 고해상도 디지털 영상과 양적 유동세포계측법을 결합하기 때문에 환자 자화율의 효율적인 캡처를위한 contemporaneously 여러 세포 인구의 조사를 용이하게합니다. 여기에서 DC가 ImageStream의 사용을 평가하기 위해 입증 TLR7 / 8인산화 및 면역 반응 8에 대한 중요한 여러 유전자의 전사를 시작하는 주요 전사 인자, NF-κB의 핵 translocation의 활성화 - 중재 증가합니다. 우리는 또한 최근 TLR5 신호와 9 노화에 변경된 면역 반응에 기여할 수 오래된 기증자로부터 monocytes에서 NF-κB 경로의 이전에 인식되지 않는 변경을 보여,이 기술을 사용했습니다.
Protocol
1. 면역 세포의 분리 및 자극
- 지역 기관 검토위원회의 지침하에 작성된 정보에 동의 후 건강한 자원자에서 10-50 ML heparinized 혈액을 구합니다. 노화 또는 질병의 연구를 위해 각 자원이나 환자에 대한 pathogenesis, 배제와 포함 조건은 명시적으로 결정되어야합니다.
- CPT 튜브 또는 Ficoll-Paque을 사용하는 플러스 격리 7 (시약, 표 1) 당일 제조 업체의 지침 (GE 헬스케어, 뉴저지)과 행동 실험에 의하면 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMCs) 분리.
- 품어 PBMCs (3 × 10 6 / 튜브) 혼자서 0.6 ML 매체에서 1.5 ML 튜브 또는 TLR의 리간드 또는 다른 활성 요원 예로 자극 TLR7 / 8 리간드 R848 (0.6 ML 매체 추가로 10 MM TLR7 / 8 리간드의 0.6 μl 10-60 분 (InvivoGen, CA) 9 37 ° C에서 R848, 최종 농도 10 μm의)가.
2. 연구소세포 eling
- 라벨 세포 혈통과 fluorescently - 복합 항체를 사용하여 라이브 세포 현탁액의 다른 표면 마커. 라벨 3 * 10 4시 20 분 6 PBMCs ° 단핵구 또는 DC lineages (표 2) 특정 표면 항체의 칵테일과 1.5 ML Eppendorf 튜브에 PBS / 2퍼센트 FBS를 100 μl의 C #. 최적 항체 dilutions이 많은 - 투 - 많은 편차를 최소화하기 위해 일괄적으로 처리되어야 예비 실험 및 샘플을 결정하실 수 있습니다. 0.1의 공급 업체 항체 주식 MG / ML은 항체의 5 μl (1시 20분 희석)을 사용합니다. 악기에 형광 채널을 설정하는 단 하나의 컬러 켤레축으로 표시 셀 별도의 튜브를 사용하십시오.
- 표면 라벨 후에 RT에서 10 분 동안 4% PFA / PBS로 세포를 고정시킨다. 스토리지에 대한 분석 시간까지, 검정 당일까지 -80시 동결 버퍼 500 XG와 resuspend 세포 (90% FBS가 DMSO 10 % 포함) ° C에서 원심 세포.
- 평가, 공정 배치 O에 대한기증자의 그룹에서 f를 치료하고 세포를 자극 함께 다양성을 최소화합니다. 분석의 날, 해동 세포를 신속하게 37에 ° C 물 목욕, 동결 버퍼를 제거하는 500x g에서 원심 분리기.
- 세포내 크린 시토킨 또는 기타 마커, 100 μl BD의 파마 / 워시 버퍼 (BD Biosciences, 뉴저지)에서 resuspend 세포 현탁액의 탐지를 위해 세포를 permeabilize합니다. 예를 들어, 20 RT에서 분, 500 XG에서 원심 분리기, 기음 뜨는 및 용 토끼 방지 NF-κB (p65) 항체의 1시 20분 희석 (최종 농도가 10 μg / ML, SantaCruz 생명 공학, CA)과 세포 내 신호 전달 구성 요소의 라벨 100 μl BD의 파마의 resuspend 세포가 / 염소 항 토끼 IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA)를 1:250 희석를 포함하는 버퍼를 씻고 RT에서 20 분 동안 품어.
- 영상으로 바로 전에, DAPI (0.2 μg / ML, Invitrogen, CA) 또는 propidium 요오드화물의 (; 20 NG / ML, Invitrogen, CA PI)와 핵 counterstain.
3. ImageStream 분석
- 인간의 샘플 사이의 다양성을 줄이기 위해 일괄 샘플에서 ImageStream하여 이미징을 실시. 488 nm의, 658 nm의 및 405 nm의 250 MW 10 MW 200 MW 다음과 같이 레이저의 전원을위한 악기 설정했다.
- 파편 (낮은 PI 강도) 또는 다세포 행사에서 단일 세포 (R1) (구별 : (높이 비율 폭) 데이터 첫번째 파일 (그림 1) 정상적인 PI 강도 높은 PI의 화면 비율과 이벤트 게이트를 분석하려면 높은 PI 강도와 낮은 비율). Monocytes은 CD14 양성 세포에 대한 게이트 안에 있습니다. mDCs은 린 1 마커 (R3)의 CD11c과 낮은 CD4 (R2)에 있으며 낮은위한 높다 전지 게이트 안에 있습니다.
- 각 세포의 활성화 정도의 효율적인 양적 척도를 제공하기 위해 (Amnis, WA) 아이디어에게 소프트웨어를 사용합니다. 핵 (R4)에 translocation을 나타내는 세포질 전사 인자 핵 염색 PI와 NF-κB의 유사성 (혹은 공동 지방화)를 결정합니다. NF-κB/PI locali의 높은 상관 관계zation는 높은 유사성 점수에 반영 및 활성화 10 정도를 나타냅니다.
- 다른 치료 그룹 또는 세포의 상대적인 기능적 효율성을 나타내는 환자 집단 사이의 유사성 비율을 비교하십시오. 절대 값 또는 배 차이의 통계적 비교를 통해 샘플간에 데이터를 계량. 인구 histograms의 핵심 세그먼트 (그림 2)에서 세포의 이미지를 표시하는 아이디어 소프트웨어를 사용합니다.
4. 대표 결과
우리는 TLR7 / 8 리간드, R848 (그림 1)과 PBMCs을 자극하여 모델 바이러스성 리간드에 반응 신호 전달 경로를 계량합니다. 우리는 우리의 샘플 그룹 (그림 2)에서 셀룰러 현지화 이미지 및 인구 통계를 모두 수집했습니다. ImageStream 우리 게이트 셀 하위 집합에 직접 PBMCs과 이미지 세포 응답의 문이 있지만, 정렬되지 않은 세포 집단에서 가능합니다. 여기 TLR s의 효과를 계량에서 NF-κB (p65)의 핵 지방화에 ignaling Lin1-, CD4 흐린, CD11c + 골수양 DC가 (mDCs). 베이스 라인에서, 우리가 세포질에서 전사 인자 NF-κB (p65)와 unstimulated 세포의 높은 비율을 관찰했다. 자극 후 치료 전지는 NF-κB (p65)가 (중간 유사성 점수는 각각 1.52과 3.01이며, 그림 자극 후 핵으로 translocated 것을 나타내는 핵 얼룩 PI와 NF-B의 상당히 높은 유사성 점수 (p65)가. 2). 비슷한 결과가 TLR5 - 자극 monocytes 9 설명되어 있습니다.
1 그림. 염색법과 인간 mDCs에 자극 효과를 계량하기위한 게이팅 전략. NF-κB의 전사 인자는 여러 면역 체계 유전자의 표현을 규정합니다. 이 연구 TLR7 / 8 리가 끝나고 대표 과목에서 mDCs에서 NF-κB (p65)의 핵 지방화를 측정 차 자극. 포커스에 하나의 세포는 높은 핵 가로 세로 비율 (R1)와 PI 긍정적인 사건에 게이팅에 의해 확인되었다. mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +)는 R3의 문이 있었다. NF-κB (p65)의 핵 지방화는 R4로 꾸몄다됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
그림 2. . 자극 후 mDCs에서 NF-κB의 Translocation은 자극 (R4) 후 핵에 NF-κB (p65)의 translocation은 치료와 자극 mDCs의 인구에 묘사된되며 평균 유사성 점수는 치료 예제에서 1.52와 3.01에있다 자극 표본 (). 치료 혹은 R848-자극 세포 집단으로 동시에 수집된 디지털 이미지는 대표 세포와 세포 핵 (B)로 translocated NF-B의 강도를 보여줍니다._upload/3741/3741fig2large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
translational 연구를위한 ImageStream의 사용에서 중요한 단계는 관련 비교 그룹 및 최적화 및 항체 특이성의 검증의 선택입니다. 분류 대상에서 대상 그룹 간의 차이점 histograms 및 세포 영상을 통해 예가 될 것입니다. 관련 수용체 및 신호 전달 경로의 변화에 대한 철저한 분석과 결합된 이러한 데이터는 전문적인 동료에 면역 dysregulation을 기초 메커니즘에 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다. 기술은 관련 대상에 대한 충분한 친화력의 특정 항체의 유무에 의해 제한됩니다. 또한, 악기는 다중 사용자 시설에 가장 적합하며 분석 소프트웨어는 어떤 치료가 습득해야합니다.
이 기술은 인간의 질병 translational 수사 강력한 기술입니다. 게놈 시퀀싱 및 배열 기술의 발전은 허용할 m에 연루 변종을 식별어떤 질병이지만 드물게 지명 유전자의 행동의 메커니즘을 파악 없습니다. 우리의 연구는 자극 후 NF-κB의 세포질 비율 핵 개별 과목 translational 수사 청사진을 제공합니다. 혈액의 작은 샘플에서, 우리는 미분이 주제 자신의 세포 혈통 특정 방식으로 처리하거나 신호를 식별할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 고령화 9 신호 전달 세포의 젊은이와 노인 과목과 시연 변경의 큰 일대의 monocytes에서 세포 반응을 계량했습니다. ImageStream 같은 치료 조치와 비 답장, 또는 치료 전후, 또는 플레어와 죄사함 동안 개별 주제에 대한 많은 조사에있는 세포의 주요 메커니즘을 강조하는 것이 더 광범위하게 적용될 수 있습니다. 주제 연구 미만 그룹, 셀 유형, 조사하는 세포 메커니즘 중 선택이 가능한 풍부한 개조로 ImageStream의 미래 응용 프로그램은 수많은 및 shoul 있습니다많은 translational 분야에서 상당한 발전을 허용 건대.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089,992, 그리고 NCRR / GCRC 프로그램 M01-RR00125)에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않고 박사 마크 Shlomchik, 예일 세포 분류기 핵심 시설의 이사 감사합니다.
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