Summary
Abstract
在免疫状况的个体差异决定的反应，感染和疾病的严重程度和结果作出贡献。老龄化与病毒和细菌感染的易感性增加和减少记录在体液下降以及细胞介导的免疫反应1,2疫苗的反应。我们最近评估Toll样受体（TLRs），检测微生物感染和触发抗菌宿主防御反应3的先天免疫系统的关键部件老化的影响。在一个健康的器官捐献者的大型队列中，我们发现，从老人的外周血单核细胞减少某些Toll样受体4和减少类似的TLR水平和树突状细胞信号反应（DCS）的表达和功能，抗原提呈细胞，关键在5先天免疫和适应性免疫之间的联系。我们已经表明巨噬细胞中TLR3的失调低层D老人捐助者的区议会感染西尼罗河病毒6,7干扰素生产。
我们的免疫衰老的理解和干预治疗的最重要的是一种特定的细胞响应类型的详细了解和信号转导机制（S）。主要通过流式细胞仪或免疫细胞和测量细胞标记成像，通过传统的免疫反应的研究进展显着，我们的理解然而，这些研究一般限于小样本量可从患者和无法进行多个复杂的实验室技术，技术上人体标本。 ImageStream同时高分辨率数字成像结合定量流式细胞仪，从而促进病人易感性的高效捕获contemporaneously调查在多个细胞群。在这里，我们展示的ImageStream在区议会的使用，以评估TLR7 / 8磷酸化和核易位的一个关键转录因子NF-κB，从而启动众多8免疫反应的关键基因的转录激活介导的增加。使用这种技术，我们最近也证明先前未确认变更的TLR5的信令和捐助者从旧的单核细胞NF-κB信号通路，可能有助于改变老化9免疫反应。
Protocol
1。免疫细胞的分离与激励
- 获得书面知情同意的当地机构审查委员会的指引下健康志愿者后10-50毫升的肝素化血。必须明确确定每个志愿者或患者的发病机制，排除和纳入标准老化或疾病的研究。
- 分离人外周血单个核细胞（PBMC）使用彩管管或Ficoll分离，Paque另外根据制造商的说明（GE Healthcare公司，新泽西州）和隔离7（试剂， 表1）天进行实验。
- 孵育1.5毫升0.6毫升培养基单独管或刺激的TLR配体或其他活化剂，如单核细胞（3×10 6 /管）TLR7 / 8配R848（0.6毫升中加0.6μL10毫米TLR7 / 8配R848，最终在37°C浓度10μM）为10-60分钟（InvivoGen，加利福尼亚州）9。
2。实验室鄂陵湖的细胞
- 标签使用荧光标记的抗体在活细胞悬浮细胞系和其他表面标志。标签3×10 6单核细胞为20分钟，4°C在100μl的PBS / 2％FBS的1.5毫升的Eppendorf管表面抗体的单核细胞或DC谱系（ 见表2）具体的鸡尾酒。初步实验和样品应分批处理，以尽量减少很多，很多的变化，可确定最佳抗体稀释。供应商抗体股票0.1毫克/毫升用5微升抗体（1:20稀释）。使用单独的细胞，只有一个单一的颜色结合，设立仪器上的荧光渠道标记的管。
- 经过表面标记，细胞固定在4％PFA / PBS在室温为10分钟。对于存储，直到时间的分析，离心机500 XG和重悬细胞在冻结缓冲区（90％FBS的含10％DMSO）在-80°C间细胞，直到一天的检测。
- 对于评估过程中分批Øf未处理和刺激细胞从一组捐助者一起，以尽量减少变异。在分析当天，解冻细胞很快在37°C水浴，离心机500XĞ清除冻结的缓冲区。
- 通透细胞检测细胞内细胞因子或其他标记，重悬细胞悬液100μL的BD彼尔姆/洗涤缓冲液（BD Biosciences公司，新泽西州）。例如，1:20稀释的兔抗NF-κB的（P65）抗体（终浓度为10微克/毫升，圣克鲁斯生物技术，加州）在室温20分钟，在500 XG离心，吸出上清液和细胞内的信号元件的标签重悬细胞100μL屋宇署权限/洗涤缓冲液1:250稀释的羊抗兔IgG-Alexa647（Invitrogen公司，加利福尼亚州）和20分钟在室温下孵育。
- 立即成像，前染液细胞核用DAPI（0.2微克/毫升，Invitrogen公司，加利福尼亚）或碘化（有价证券; 20毫微克/毫升，Invitrogen公司，加利福尼亚）。
3。 ImageStream分析
- 批次样品进行成像技术，以减少人类样本之间的变异ImageStream。功率的激光仪器设置如下：200毫瓦为488纳米，10毫瓦为658纳米，405纳米和250兆瓦。
- 分析数据文件（ 图1），第一门事件与正常PI强度和高PI宽高比（宽：高比例），以区分单细胞碎片（低强度）有价证券或多细胞活动（R1）（有价证券投资高强度和低展弦比）。单核细胞内细胞CD14阳性细胞的大门。 MDCS是在一个细胞，CD11c和低CD4（R）和林1标记（4915）也低高门。
- 用意念软件（Amnis，WA）提供一个有效的每个细胞的活化程度的定量测量。确定细胞质转录因子NF-κB核染料PI（或合作本地化）的相似性表明易位进入细胞核（R4）的。一个高NF-κB/PIlocali相关zation体现在一个高的相似性得分，并表示激活10度。
- 比较不同的治疗组患者人群，表明细胞的功能相对效率之间的相似性比率。通过绝对值或倍差异的统计比较量化的样本之间的数据。用意念从人口直方图的关键环节（ 图2）显示细胞图像的软件。
4。代表结果
我们TLR7 / 8配，R848（ 图1）刺激单核细胞的信号转导通路在病毒配体模型量化。我们收集的细胞定位图像和人口统计数字，在我们的样本组（ 图2）。 ImageStream让我们门细胞亚群，直接从单核细胞和图像细胞的反应，从门，但无序的细胞群。在这里，我们量化的TLR小号的影响ignaling核定的NF-κB（P65）在林1，CD4 +暗淡，素CD11c +髓区议会（MDCS）。基线时，我们发现高比例的未刺激细胞转录因子在细胞质中的NF-κB（P65）。刺激后，细胞治疗有显着较高的相似性的NF-κB核染色的PI得分（P65），刺激后的NF-κB（P65）易位进入细胞核（中位数的相似性得分分别为1.52和3.01， 图。 2）。类似的结果指出在TLR5的刺激单核细胞9。
图1。染色和的浇注战略量化对人类MDCS的刺激作用 。转录因子NF-κB的调节许多免疫系统的基因表达。本研究措施，在从一个有代表性的主题MDCS TLR7 / 8西甲后核定的NF-κB（P65）第二刺激。在集中单一细胞进行鉴定，门上高核长宽比（R1）的PI阳性事件。 MDCS（林1，CD4dim，素CD11c +）在R3门。核本地化的NF-κB（P65）在R4绘制。 点击这里查看大图 。
图2。 MDCS刺激后NF-κB的易位，易位进入细胞核（R4）的刺激后的NF-κB（P65）被描绘在未处理和刺激MDCS种群，在未经处理的样品的相似性得分中位数是1.52和3.01刺激的样品（一）。未经处理或R848刺激的细胞群，同时收集的数字图像显示易位进入细胞核（二）代表细胞和NF-B的强度。_upload/3741/3741fig2large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
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Discussion
ImageStream用于翻译研究的关键步骤是选择相关的对照组和特异性抗体的优化和验证。主题标记的目标群体之间的差异是显而易见的，通过直方图和细胞图像。结合深入分析了有关的受体和信号通路的变化，这些数据将提供宝贵的见解机制的基础免疫失调，在专门的同伙。该技术将受到足够的亲和力有关目标的特异性抗体的可用性。此外，该仪器是最适合多用户设施和分析软件，需要掌握一些护理。
这种技术是一种强大的技术为人类疾病的翻译调查。在基因组测序和阵列技术的进步已经允许在M牵连识别变种任何疾病，但很少确定提名基因的作用机制。我们的研究提供了一个蓝图，在个别科目，如细胞质比刺激后NF-κB的核转化调查。从少量血液样本，我们可以找出在主题的自身细胞谱系的具体方式处理或信号差。使用这种方法，我们已经量化在一个大型世代的年轻人和老年人的主体和细胞在9衰老信号表明改建的单核细胞的反应。 ImageStream，可应用于更广泛的细胞中突出的关键机制，在许多调查，如治疗反应和无反应，或为治疗前，后，或在耀斑和缓解个别科目。 ImageStream未来的应用与丰富的修改正在研究的学科群，类型的细胞，细胞的机制，以调查可能的选择，许多建议立即进行删除倒是让许多翻译领域的重大进展。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的一部分，由美国国立卫生研究院（N01，HHSN272201100019C，19岁以下人工智能089992，NCRR / GCRC计划M01-RR00125的）。作者声明没有竞争的金融利益，并感谢的马克Shlomchik博士，耶鲁大学的细胞分选仪的核心设施。
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