Chromatin immunoprecipitation (चिप) का उपयोग ड्रोसोफिला ऊतक
Summary
हाल ही में उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकी बहुत Chromatin immunoprecipitation (चिप) के प्रयोग की संवेदनशीलता बढ़ गया है और शुद्ध कोशिकाओं या विच्छेदित ऊतक का उपयोग कर अपने आवेदन को प्रेरित किया. यहाँ हम एक विधि के साथ चिप तकनीक का उपयोग चित्रित करना<em> ड्रोसोफिला</em> ऊतक है, जो एक अच्छी तरह से विशेषता जैविक प्रणाली में अंतर्जात chromatin राज्य पता कर सकते हैं.
Abstract
Epigenetics एक तेजी से विकसित क्षेत्र बना हुआ है कि पढ़ाई कैसे chromatin राज्य अंतर विभिन्न विकास के चरणों पर विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के लिए योगदान देता है. Epigenetic विनियमन भ्रूण विकास और वयस्कता में homeostasis के दौरान सेलुलर भेदभाव सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए योगदान देता है. Epigenetic अध्ययन में जांच करने के लिए कैसे विभिन्न histone संशोधनों और chromatin कारक जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति है. इस पते, chromatin immunoprecipitation (चिप) व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है ब्याज की कोशिकाओं में डीएनए के साथ विशेष कारकों के सहयोग के एक स्नैपशॉट प्राप्त करने.
चिप तकनीक आमतौर पर सामग्री है, जो बहुतायत और एकरूपता में प्राप्त किया जा सकता है प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा उत्पन्न करने के लिए शुरू के रूप में संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग करता है. हालांकि, वहाँ कई caveats हैं: पहला, पेट्री डिश में कोशिकाओं के विकास का वातावरण vivo में से अलग है, इस प्रकार हो सकता हैएक जीवित जीव में कोशिकाओं की अंतर्जात chromatin राज्य को प्रतिबिंबित नहीं. दूसरा, कोशिकाओं के सभी प्रकार सुसंस्कृत पूर्व vivo हो सकता है. सेल लाइनों का केवल एक सीमित संख्या है, जिसमें से लोगों के चिप परख लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त कर सकते हैं.
यहाँ हम एक चिप ड्रोसोफिला ऊतकों का उपयोग करके प्रयोग करने की विधि वर्णन. शुरू सामग्री एक जीवित पशु से ऊतक विच्छेदित है, इस प्रकार सही अंतर्जात chromatin से राज्य को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. ऊतक के कई अलग अलग प्रकार के साथ इस पद्धति का अनुकूलन क्षमता के शोधकर्ताओं ने एक बहुत अधिक जैविक प्रासंगिक vivo में 1, 2 में epigenetic विनियमन के बारे में सवालों को संबोधित करने की अनुमति देगा. उच्च throughput अनुक्रमण (चिप seq) के साथ इस पद्धति संयोजन आगे शोधकर्ताओं ने एक epigenomic परिदृश्य को प्राप्त करने के लिए अनुमति देगा.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल में चर्चा चिप विश्लेषण की बहुमुखी प्रतिभा के विभिन्न ऊतकों, जो एक biologically प्रासंगिक प्रणाली में chromatin राज्य अध्ययन का अवसर प्रदान करता है पर इस्तेमाल किया जा सकता है. चिप सुसंस्कृत सिस्टम से क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के डा. Keji झाओ प्रयोगशाला (NIH / NHLBI) अनुक्रमण परिणाम प्रदान करने में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी के UCSC जीनोम परियोजना जीनोम ब्राउज़र का उपयोग करने के लिए मैप अनुक्रमण पढ़ता कल्पना के लिए शुक्रिया अदा करना होगा.
यह काम स्वतंत्रता पुरस्कार और NICHD, Lucile Parkard फाउंडेशन, और जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय से R01HD065816 शुरू XC के लिए धन R00HD055052 एनआईएच मार्ग द्वारा समर्थित किया गया है
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
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