Summary
विशिष्ट glycosidases का उपयोग करने के लिए एसडीएस - पेज द्वारा पीछा glycoproteins से शर्करा को दूर करने के लिए प्रोटीन के नमूने पर glycan संशोधन का पता लगाने के लिए एक मूल्यवान तरीका है और प्रारंभिक glycobiology के अध्ययन के लिए एक अच्छा विकल्प है है. Deglycosylation निम्नलिखित परिवर्तन जेल गतिशीलता में बदलाव के रूप में या glycan संवेदनशील अभिकर्मकों के साथ धुंधला करके पता लगाया जा सकता है.
Protocol
1. Enzymatic deglycosylation
- पीसीआर ट्यूब का उपयोग करने के लिए कम से कम पानी के वाष्पीकरण के कारण नुकसान. लेबल 1 ट्यूबों के 7 सेट.
- G7 बफर 10X, 10X ग्लाइकोप्रोटीन denaturing बफर, और 10% NP-40 पहले गला लें और धीरे ट्यूबों नल के लिए सामग्री मिश्रण. कमरे के तापमान पर रखें.
- बर्फ पर एंजाइम युक्त शीशियों रखें. पिघलना / फ्रीज चक्र को कम करने की कोशिश करो.
- DH 2 हे के 600 μl में hCGβ शीशी (150 μg) की सामग्री को भंग करने और बर्फ पर रख.
- DH 2 ओ में 10X शेयर गिराए 1X G7 बफर के 1 मिलीलीटर की तैयारी
- 25 μl 1X G7 बफर में PNGase एफ 0.5 μl पतला और बर्फ पर रख.
- 2 μl α-N-Acetylgalactosaminidase प्रत्येक α1-2 Fucosidase β1-3 Galactosidase, और α1-3, 6 Galactosidase के संयोजन द्वारा exoglycosidase मिश्रण (जैसे मिश्रण) तैयार करें .
- पीसीआर ट्यूब के रूप में सेट संकेत:
| ट्यूब नमूना / # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| hCGβ (0.25mg/ml) | 9μl | 9μl | 9μl | 9μl | - | - | - |
| 10X glycoprotein बफर denaturing | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
| DH 2 हे | - | - | - | - | 9μl | 9μl | 9μl |
- ट्यूबों कैप, धीरे और मिश्रण में जगहthermocycler, ढक्कन बंद और 94 पर 10 मिनट incubating प्रोटीन denature · सी, एक 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ द्वारा पीछा किया (एक thermocycler में पीसीआर ट्यूब का उपयोग बहुत छोटी मात्रा के नमूने में में वाष्पीकरण रोकता है).
- Thermocycler से ट्यूबों निकालें और किसी भी दृश्य संक्षेपण हटायें अपकेंद्रित्र.
- निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें रूप में संकेत दिया:
| नमूना # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 10% एनपी 40 | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl |
| 10X G7 बफर | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5 और म्यू, एल | 2.5μl |
| PNGase एफ 1:50 दिल. | - | 2μl | - | - | 2μl | - | - |
| Deglycosylation मिक्स | - | - | 2μl | 2μl | - | 2μl | 2μl |
| ईजी मिश्रण | - | - | - | 2μl | - | - | 2μl |
| DH 2 हे | 10μl | 8μl | 8μl | 6μl | 8μl | 8μl | 6μl |
| कुल प्रतिक्रिया Vol. | 25 μ एल | 25 μ एल | 25 μ एल | 25 μ एल </ P> | 25 μ एल | 25 μ एल | 25 μ एल |
- पीसीआर ट्यूब नई टोपियां (इस्तेमाल लोगों त्यागने के बाद से वे एक ऊष्मायन चक्र के बाद ठीक से फिट नहीं है) का उपयोग कर बंद करो.
- धीरे से 4 बार दोहन और तब सामग्री स्पिन नीचे ट्यूबों मिक्स.
- 37 पर thermocycler और सेते में ट्यूब प्लेस ° 4 घंटे के लिए तो सी डिग्री सेल्सियस 4 नमूने शांत
2. Deglycosylated नमूने के एसडीएस पृष्ठ
- 130 μl ताजा 3X कम करने एसडीएस लोड हो रहा है बफर 1.25M डीटीटी के 4 μl जोड़कर तैयार करें.
- प्रत्येक नमूने के लिए तैयार 3X कम करने एसडीएस लोड हो रहा है बफर के 12.5 μl जोड़ें.
- नई टोपी के साथ ट्यूब बंद करें और धीरे ट्यूबों नल करने के लिए मिश्रण.
- 94 पर एक thermocycler में ट्यूबों सेते डिग्री सेल्सियस 5 मिनट और फिर डिग्री सेल्सियस 4 शांत करने के लिए के लिए
- प्रत्येक नमूने के 30 μl और एक 10-20% Tris-Glycine जेल पर प्रोटीन मार्कर के 10 μl लोड. 3.1 भाग के लिए नमूने के शेष सहेजें. कलर प्लस Prestained प्रोटीन मार्कर के 10μl लोड.
- 130 वोल्ट पर कमरे के तापमान पर जेल तक डाई सामने जेल के नीचे स्थित है Electrophorese.
- जब जेल चल रहा समाप्त हो गया है, कलाकारों से जेल को हटाने और यह पर्याप्त Coomasie जेल कवर दाग नीले के साथ एक छोटे से प्लास्टिक बॉक्स में जगह है.
- कोमल आंदोलन के साथ एक घंटे के लिए जेल दाग.
- 30 मिनट के लिए destain समाधान के 50 मिलीलीटर में जेल में तीन बार धोएं.
- एक सफेद रोशनी transilluminator या स्कैनर का उपयोग कर छवियों रिकॉर्ड. वैकल्पिक रूप से, एक फ्रेम में जेल सिलोफ़न की चादरों के बीच सूख जा सकता है.
3. प्रो - क्यू ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए एसडीएस पृष्ठ जैल में 300 पन्ना
- 2.1 में जेल) के साथ समानांतर में एक 10-20% Tris-Glycine जेल पर नमूने के शेष लोड. 10 लोड और म्यू, कलर प्लस Prestained प्रोटीन मार्कर के एल.
- जबकि जेल DMF के साथ प्रो - क्यू पन्ना अभिकर्मक भंग करने और शेयर फिक्स धो तैयार चल रहा है और प्रो - क्यू 300 पन्ना के लिए समाधान ऑक्सीकरण उत्पाद किट के साथ प्रदान पुस्तिका निम्नलिखित दाग.
- जब वैद्युतकणसंचलन पूरा हो गया है, कलाकारों से जेल को हटाने और एक प्लास्टिक के बॉक्स में जगह है.
- फिक्स समाधान के 100 मिलीलीटर जोड़ने और यह रातोरात कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर छोड़ द्वारा जेल फिक्स.
- बुतपरस्त आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 10 से 20 मिनट के लिए धो समाधान के 100 मिलीलीटर के साथ जेल धो लें. ताजा धो समाधान के साथ धो दोहराएँ.
- कोमल आंदोलन के साथ समाधान ऑक्सीकरण के 25 मिलीलीटर में 30 मिनट के लिए जेल incubating द्वारा कार्बोहाइड्रेट oxidize.
- जेल धो 3.5 चरण में वर्णित के रूप में.
- जबकि जेल समर्थक क्यू पन्ना 300 अभिकर्मक समाधान 3.2 चरण में 25 मिलीलीटर भंग के 500 μl जोड़कर ताजा प्रो - क्यू पन्ना 300 दाग तैयार धोने हैकिट में दिए गए बफर धुंधला.
- 3.8 चरण में दाग तैयार की 25 मिलीलीटर जोड़ने और 90 से 120 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ अंधेरे में incubating द्वारा जेल दाग.
- दो धोने 3.5 चरण में वर्णित चरणों को दोहराएँ.
- 300nm पर एक यूवी transilluminator के साथ छवियों को रिकार्ड. 80 केडीए मार्कर, जो प्रो - क्यू Emerald ग्रीन के साथ लेबल का उपयोग prestained सीढ़ी दिखा जेल के एक सफेद रोशनी चित्र यूवी छवि ओवरलैप.
- 2.10 3.11 कदम से प्रो - क्यू पन्ना दाग जेल के साथ कदम में Coomasie दाग जेल की छवियों की तुलना करें.
4. प्रतिनिधि परिणाम
एंजाइमी deglycosylation के बाद प्रोटीन के प्रवास में परिवर्तन चित्रा 2 में दिखाया जाता है. नियंत्रण नमूना PNGase एफ उपचार (एन glycans हटाने, 2 लेन), और Deglycosylation मिक्स (PNGase एफ, एंडो और लेन exoglycosidases हे glycans हटायें, प्लस 3) के साथ तुलना (पैनल, एक लेन 1) . आगे कोई कमीआकार में अतिरिक्त glycosidases (4 लेन) के साथ पचाने के बाद देखा है. मास में एक बदलाव के अलावा, बैंड तेज हो glycans के रूप में हटा रहे हैं. एक 17 केडीए मार्कर (तारांकन) के तहत चल रहे बैंड पूरी तरह hCGβ deglycosylated पॉलीपेप्टाइड (: 16 केडीए मेगावाट) का प्रतिनिधित्व करता है. अन्य बैंड अधूरा deglycosylation से या कई अज्ञात hCGβ नमूने में मौजूद प्रोटीन (लेन 1 देखें) से प्राप्त हो सकता है. 5 से 7 लेन (नियंत्रण) glycosidases करने के लिए इसी बैंड दिखा.
Emerald ग्रीन द्वारा ग्लाइकोप्रोटीन धुंधला पैनल बी में दिखाया गया है, यह अभिकर्मक oxidizes और दाग सभी एक प्रोटीन अणु में मौजूद glycans. इसलिए संकेत की तीव्रता कम हो जाती है के रूप में hCGβ enzymatically (लेन 1 से 4 लेन करने के लिए) deglycosylated. गलियों 3 और 4 में अवशिष्ट संकेत glycan रूपांकनों, जो इस्तेमाल किया एंजाइमों के लिए प्रतिरोधी रहे हैं की उपस्थिति का संकेत मिलता है. अतिरिक्त 4 लेन में इस्तेमाल किया glycosidases कुछ अतिरिक्त चीनी अवशेषों को निकालने के लिए: प्रोटीन प्रवास ही है, लेकिनधुंधला में एक तीव्रता में मामूली कमी देखा जा सकता है. प्रतिरोधी चीनी moieties सभी प्रजातियों में प्रोटीन मौजूद नहीं थे: कुछ बैंड Emerald ग्रीन (यूवी छवि में अनुपस्थित, कोष्ठक में) पता नहीं थे, यह दर्शाता है वे बड़े पैमाने पर deglycosylated थे. अतिरिक्त डेटा निष्कर्ष है कि hCGβ विभिन्नतापूर्वक ग्लाइकोसिलेटेड है समर्थन करते हैं. 2 लेन (तीर) पर कम बैंड Emerald ग्रीन छवि पर बेहोश है, जबकि 2 लेन पर ऊपरी बैंड उज्ज्वल है, यह दर्शाता है कि कई glycans समूहों अभी भी मौजूद हैं. इन आंकड़ों निष्कर्ष है कि पुनः संयोजक माउस कोशिकाओं में व्यक्त hCGβ एकाधिक glycoforms 9 शामिल हैं का समर्थन करते हैं . ये अलग glycoforms ग्लाइकोसिलेशन जहां कुछ polypeptides प्रत्येक सर्वसम्मति साइट और / या कुछ glycans में एक glycan प्राप्त नहीं की अंतर्निहित विविधता की वजह से हैं, जबकि एक ही प्रोटीन पर भी दूसरों को नहीं कर रहे हैं बढ़ा रहे हैं.
चित्रा 1.Secreted है या सेल सतह glycoproteins के लिए विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न.
चित्रा 2. एसडीएस पृष्ठ hCGβ के enzymatic deglycosylation दिखा जैल. पैनल एक Coomasie नीले रंग धुंधला से पता चलता है जबकि पैनल बी ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के दृश्य के लिए प्रो - क्यू पन्ना 300 के परिणामों से पता चलता है. नमूना संख्या: 1, hCGβ नियंत्रण, 3, Deglycosylation मिक्स पाचन, 4, Deglycosylation मिक्स प्लस exoglycosidases पाचन, नमूने 5 से 7 अभिकर्मक नियंत्रण कर रहे हैं (हे - Glyc, हे Glycosidase, GNA, β - एन 2, एफ पाचन PNGase Acetylglucosaminidase, लड़की / fuc, β1-3 Galactosidase, α1-3, Galactosidase 6, और α1-2 Fucosidase; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase, Neu, neuraminidase; PNGase, PNGase एफ)
Discussion
विधि यहाँ वर्णित एंजाइमी deglycosylation और एसडीएस पृष्ठ का उपयोग ब्याज की एक प्रोटीन की ग्लाइकोसिलेशन राज्य के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जबकि glycan विशेष अभिकर्मकों डेटा की व्याख्या की सुविधा. इस प्रोटोकॉल प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के प्रारंभिक अध्ययन के लिए इरादा है और यह विशेष रूप से स्रावी और स्तनधारी कोशिकाओं से झिल्ली glycoproteins के लिए अनुकूल है: इस मामले में चुना एंजाइमों विशेष रूप से सभी एन - glycans को हटाने जाएगा और या एन glycans प्लस और सबसे आम शर्करा विस्तार और हे glycans की कोर का गठन . Glycosidases हल्के होने का अतिरिक्त लाभ है, रासायनिक deglycosylation तरीकों के साथ तुलना में, दोनों शर्करा और प्रोटीन रीढ़ की अखंडता बनाए रखने.
अधिभोग का दर (जो एमिनो एसिड ग्लाइकोसिलेटेड हैं), ग्लाइकोसिलेशन की हद तक, या glycans के ठीक संरचना, ऐसे मी के रूप में में और अधिक परिष्कृत तकनीक का निर्धारण स्पष्टगधा स्पेक्ट्रोमेट्री, तरल क्रोमैटोग्राफी या एनएमआर आवश्यक हैं.
अपनी सादगी की वजह से, इस प्रोटोकॉल में कई कदम, समायोजित किया जा सकता एवजी है, और / या विभिन्न प्रयोगात्मक जरूरतों को समायोजित करने के लिए संयुक्त. हालांकि, के क्रम में परिणाम है कि स्पष्ट रूप से व्याख्या की जा सकती प्राप्त करने के लिए यह महत्वपूर्ण है के लिए अपनी शक्तियों और सीमाओं को समझने. सबसे पहले, विशिष्टता और glycosidases की शुद्धता महत्वपूर्ण हैं: केवल अच्छी तरह से विशेषता एंजाइमों proteases और अन्य गतिविधियों contaminating के मुक्त होने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. दुर्भाग्य से, वहाँ glycosidases के लिए कोई मानक एंजाइम इकाई परिभाषा है, उपयोगकर्ता निर्माता विनिर्देशों के अनुसार उपयुक्त प्रतिस्थापन निर्धारित करना चाहिए. दूसरा, का पता लगाने के एक सावधान पसंद जरूरी है:) प्रोटीन धुंधला अभिकर्मकों उपयोगी होते हैं केवल आणविक जन में एक महत्वपूर्ण बदलाव में deglycosylation परिणाम अगर. इस तरह के एक स्पष्ट परिणाम के रूप में यहाँ दिखाया हमेशा प्राप्त नहीं है. अन्य मामलों में, हम असामान्य मील देखा हैdeglycosylation बाद gration भविष्यवाणी की आणविक वजन, या भी धीमी प्रवास (दूर से). इस घटना अच्छी तरह समझ नहीं है, लेकिन यह कहा जा सकता है कि प्रवास में किसी भी परिवर्तन सबूत है कि प्रोटीन deglycosylated किया गया है ख) एंटीबॉडी के साथ चीनी का पता लगाने में अद्वितीय चुनौतियों उनकी प्रयोज्यता सीमित प्रस्तुत करता है.. यह बहुत मुश्किल सामान्य विरोधी glycan एंटीबॉडी उत्पन्न किया गया है, वे आम तौर पर एक जटिल glycan लक्ष्य है, जो उनके उपयोग को प्रतिबंधित के खिलाफ उठाया जाता है. इसके अलावा, कई मोनोक्लोनल विरोधी glycan एंटीबॉडी अवांछित पार जेट 10 प्रदर्शित ग) lectins (आंतरिक चीनी आत्मीयता के साथ प्रोटीन) अच्छी तरह से चीनी का पता लगाने के लिए अनुकूल हैं, प्लस वे glycan संरचना पर अंतर्दृष्टि दे .. हालांकि, उन सभी को नहीं एक संकीर्ण विशिष्टता है, और कई केवल आंशिक रूप से (जिसका अर्थ है कि वे अज्ञात समानताएं हो सकता है) विशेषता है. के रूप में एक परिणाम सकारात्मक लेक्टिन धुंधला एक सैनिक की उपस्थिति का संकेत सबूत है, नहीं, प्रदान करता हैउपक्रम चीनी घ) रासायनिक लेबलिंग किट (शर्करा की periodate ऑक्सीकरण पर आधारित) पसंद की विधि सभी glycoproteins दाग रहे हैं, और इस प्रकार अच्छी तरह से deglycosylation का पालन करने के लिए अनुकूल है.
जब एक अज्ञात नमूना प्रसंस्करण, यह ग्लाइकोप्रोटीन नियंत्रण को शामिल करने के लिए एक अच्छा अभ्यास है. Fetuin एक एन आसानी से उपलब्ध है और हे ग्लाइकोप्रोटीन, chorionic gonadotropin (दोनों सब यूनिटों) भी एक अच्छा विकल्प है. गोजातीय सीरम albumin (BSA) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि कुछ गैर ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन समर्थक क्यू पन्ना 300 के साथ थोड़ा प्रतिक्रिया, खासकर जब उच्च सांद्रता में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. गैर ग्लाइकोसिलेटेड prestained प्रोटीन इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता मार्कर के रूप में आणविक भार मानकों, तेज बैंड को प्रदर्शित करने का लाभ है. केवल मौका द्वारा इन (80 केडीए) प्रोटीन समर्थक क्यू पन्ना 300 करने के लिए प्रतिक्रियाशील है. इसलिए, उपयोगकर्ता के लिए एक glycoprotein मानक सीढ़ी बजाय चलाने चाहते हैं, Invitroge से इस तरह के रूप में कैंडी - केनएन
अंत में, सरल का पता लगाने में जेल nucleocytosolic glycoproteins (जो एक एकल O-GlcNAc के साथ संशोधित कर रहे हैं) के एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उपयोग के साथ संभव है, विशिष्टता 11 नियंत्रण के लिए β एन Acetylglucosaminidase साथ इस तकनीक का वर्णन से परे है . के रूप में glycosidases कई अन्य glycoproteins और glycoconjugates कोशिकाओं में मौजूद के अध्ययन के लिए उपयोगी उपकरण हैं इस लेख के दायरे, लेकिन यह उल्लेख किया जाना चाहिए. ग्लाइकोसिलेशन के सभी ज्ञात रूपों का एक व्यापक उपचार "Glycobiology के अनिवार्य है" के दूसरे संस्करण में पाया जा सकता है है: 12; NCBI (20,301,239 PMID NBK1908 Bookshelf आईडी) Bookshelf पर मुफ्त उपलब्ध ऑनलाइन, .
Disclosures
लेखकों न्यू इंग्लैंड Biolabs, जो इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के कई उत्पादन द्वारा नियोजित कर रहे हैं.
Acknowledgments
डॉन कंघी
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human chorionic gonadotropin β | Sigma-Aldrich | C6572 | |
| PCR Tubes | VWR international | 20170-004 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
| Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
| α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
| α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
| α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
| β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
| 10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10% NP-40 | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
| ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
| 10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
| Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
| Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
| Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
| Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B0149 | |
| AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |
References
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