Identifikation og karakterisering af protein glycosylation bruge specifikke endo-og exoglycosidases

Summary

Brug af specifikke glycosidases at fjerne sukker fra glycoproteiner efterfulgt af SDS-PAGE er en værdifuld metode til at påvise glycan ændringer på protein prøver og er et godt valg til den indledende glycobiology studier. Ændringer følgende deglycosylation kan detekteres som ændringer i gel mobilitet eller ved farvning med glycan følsomme reagenser.

Abstract

Glykosylering, tilføjelse af kovalentforbundne sukker, er en stor post-translationelle ændring af proteiner, der væsentligt kan påvirke processer såsom celleadhæsionsmolekyle, molekylær menneskehandel, clearance, og signal transduktion ^1-4. I eukaryoter, er den mest almindelige glykosylering ændringer i Udskillelsen tilføjelser til enighed asparagin rester (N-linked) eller på serin eller threonin restprodukter (O-linked) (Figur 1). Indledning af N-glycan syntese er meget bevares i eukaryoter, mens slutprodukterne kan variere meget mellem forskellige arter, væv eller proteiner. Nogle glycans forblive uændrede ("high mannose N-glycans") eller forarbejdes yderligere i Golgi ("komplekse N-glycans"). Større mangfoldighed er fundet for O-glycans, som starter med en fælles N-Acetylgalactosamine (GalNAc) rester i animalske celler, men adskiller sig i lavere organismer ^1.

ENT "> Den detaljerede analyse af glykosylering af proteiner er et område i sig selv og kræver omfattende ressourcer og ekspertise til at udføre ordentligt. Men en række af de tilgængelige enzymer, der fjerner sukker (glycosidases) gør det muligt at have en generel idé om glycosylation status . et protein i en standard laboratorium indstilling Her har vi illustrere brugen af glycosidases til analyse af en model glycoprotein:. rekombinant humant choriongonadotropin beta (hCGβ), som bærer to N-glycans og fire O-glycans ⁵ Den teknik kræver kun simple instrumentering og typiske forbrugsvarer, og det kan let tilpasses til analyse af flere glycoprotein prøver.

Flere enzymer kan bruges i parallelt at studere et glycoprotein. PNGase F er i stand til at fjerne næsten alle typer af N-linked glycans ^6,7. For O-glycans, er der ingen tilgængelig enzym, som kan kløve en intakt oligosaccharid fra the protein backbone. I stedet er O-glycans trimmes ved exoglycosidases til en kort kerne, som derefter let kan fjernes ved O-Glycosidase. Den Protein Deglycosylation Mix indeholder PNGase F, O-Glycosidase, neuraminidase (sialidase), β1-4 galactosidase, og β-N-Acetylglucosaminidase. Det bruges til samtidigt at fjerne N-glycans og nogle O-glycans ^8. Endelig blev Deglycosylation Mix suppleret med en blanding af andre exoglycosidases (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 galactosidase, og β1-3 galactosidase), hvilket bidrager til at fjerne ellers resistente monosaccharider, der kunne være til stede i visse O-glycans.

SDS-PAGE/Coomasie blå er brugt til at visualisere forskelle i protein migration før og efter glycosidase behandling. Desuden viser en sukker-specifik farvning metode, ProQ Emerald-300, formindsket signal som glycans er successively fjernet. Denne protokol er designet til analyse af små mængder af glycoprotein (0,5 til 2 mg), selv om enzymatisk deglycosylation kan skaleres op til at rumme større mængder af protein efter behov.

Protocol

1. Enzymatisk deglycosylation

1. Brug PCR-rør for at minimere tab af vand på grund af fordampning. Mærk et sæt rør 1 til 7.
2. Optø 10X G7 buffer, de 10X glykoprotein denaturering buffer, og 10% NP-40 og blidt tryk på rørene for at blande indholdet. Opbevares ved stuetemperatur.
3. Placer enzym-holdige hætteglas på is. Prøv at minimere tø / fryse cykler.
4. Opløs indholdet af hCGβ hætteglas (150 mg) i 600 μl af dH ₂ O og holde på is.
5. Forbered 1 ml 1X G7-buffer ved at fortynde 10X bestanden i dH ₂ O.
6. Fortynd 0,5 μl af PNGase F i 25 μl 1X G7-buffer og holde på is.
7. Forbered exoglycosidase mix (EG mix) ved at kombinere 2 μl hver af α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1-3 galactosidase, og α1-3, 6 galactosidase.
8. Opsætning af PCR rør som anført:

k ">

Tube / prøve #	1	2	3	4	5	6	7
hCGβ (0.25mg/ml)	9μl	9μl	9μl	9μl	-	-	-
10X Glykoprotein Denaturering Buffer	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl
dH 2 O	-	-	-	-	9μl	9μl	9μl

9. Cap rørene, bland forsigtigt og plads ithermocycler, lukke låget og denaturere proteiner ved at inkubere 10 minutter ved 94 ° C, efterfulgt af et 4 ° C hold (ved hjælp af PCR-rør i en thermocycler i høj grad forhindrer fordampning i små volumina).
10. Fjern rørene fra thermocycler og centrifugeres for at fjerne eventuelle synlige kondens.
11. Tilføj følgende reagenser som anført:

Sample #	1	2	3	4	5	6	7
10% NP-40	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl
10X G7 Buffer	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2,5 & muL	2.5μl
PNGase F 1:50 DIL.	-	2μl	-	-	2μl	-	-
Deglycosylation Mix	-	-	2μl	2μl	-	2μl	2μl
EG mix	-	-	-	2μl	-	-	2μl
dH 2 O	10μl	8μl	8μl	6μl	8μl	8μl	6μl
Samlet reaktion bd.	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l </ Td>	25 μ l	25 μ l	25 μ l

12. Luk PCR-rør ved hjælp af nye hætter (kassér den brugte dem, da de ikke passer ordentligt efter en inkubationstid cyklus).
13. Bland rørene ved forsigtigt at banke 4 gange og derefter dreje indholdet ned.
14. Placér rørene i thermocycler og inkuberes ved 37 ° C i 4 timer efterfulgt afkøle prøverne til 4 ° C.

2. SDS-PAGE af deglycosylated prøver

1. Klargør 130 μl frisk 3X reducere SDS loading buffer ved at tilføje 4 μl af 1,25 m DTT.
2. Tilsæt 12,5 μl af den forberedte 3X reducere SDS loading buffer til hver prøve.
3. Luk rørene med nye hætter og blidt tryk på rørene for at blande.
4. Inkubér rør i en thermocycler ved 94 ° C i 5 minutter og afkoeles derefter til 4 ° C.
5. Belastning 30 μl af hver prøve og 10 μl af proteinet markør på en 10-20% Tris-Glycine gel. Gem resten af ​​prøven til del 3.1. Load 10μl af ColorPlus Prestained Protein Marker.
6. Electrophorese gelen ved 130 volt ved stuetemperatur, indtil farvefronten er nær bunden af ​​gelen.
7. Når gelen er færdig med at køre, skal du fjerne gel fra skuespillerne og placer den i en lille plastboks med nok Coomasie blåsplint at dække gel.
8. Farv gelen i 1 time med rolige bevægelser.
9. Vask gel tre gange i 30 minutter i 50 ml affarves løsning.
10. Optag billeder ved hjælp af et hvidt lys transilluminator eller scanner. Alternativt kan gelen tørres mellem ark cellofan i en ramme.

3. Pro-Q Emerald 300 til påvisning af glykosyleret proteiner i SDS-PAGE geler

1. Parallelt med gel i 2,1), skal du lægge den resterende del af prøverne på en 10-20% Tris-Glycine gel. Load 10 & MU, L ColorPlus Prestained Protein Marker.
2. Mens gel kører opløse Pro-Q Emerald reagens med DMF og forberede bestanden Fix, Vask og oxiderende løsninger for Pro-Q Emerald 300 pletten efter produkt manual følger med sættet.
3. Når elektroforese er afsluttet, fjernes gelen fra skuespillerne og læg den i en plastboks.
4. Fix gel ved at tilsætte 100 ml af Fix løsning og lade det være natten over ved stuetemperatur med rolige bevægelser.
5. Vask gelen med 100 ml af Wash løsning for 10 til 20 minutter ved stuetemperatur med gentile agitation. Gentag Vask med frisk Wash løsning.
6. Oxidere kulhydrater ved inkubation af gel med rolige bevægelser i 30 minutter i 25 ml af oxiderende løsning.
7. Vask gel som beskrevet i trin 3.5.
8. Mens gel er vask forberede frisk Pro-Q Emerald 300 pletten ved at tilsætte 500 μl af Pro-Q Emerald 300 reagensopløsningen opløst i trin fra 3,2 til 25 mlfarvning buffer forudsat i sættet.
9. Farv gelen ved at tilsætte 25 ml af pletten forberedt i trin 3,8 og ruge i mørket med rolige bevægelser i 90 til 120 minutter.
10. Gentag de to vaske trin beskrevet i trin 3.5.
11. Optag billeder med en UV transilluminator på 300nm. Brug de 80 kDa markør, der er mærket med Pro-Q Emerald Green, at overlappe UV-billede til et hvidt lys billede af gelen viser prestained stigen.
12. Sammenlign billederne af Coomasie farvede gel i takt 2,10 med Pro-Q Emerald farvet gel fra trin 3.11.

4. Repræsentative resultater

Ændringerne i protein migration efter enzymatisk deglycosylation er vist i figur 2. Sammenlign kontrolprøven (panel A, lane 1) med PNGase F behandling (fjernelse af N-glycans, Lane 2), og Deglycosylation Mix (PNGase F; plus endo-og exoglycosidases til at fjerne O-glycans, bane 3). Ingen yderligere reduktioni størrelse ses efter fordøje med ekstra glycosidases (bane 4). Udover en ændring i masse, bliver bands skarpere som glycans fjernes. Et band kører under de 17 kDa markør (stjerne) repræsenterer den fuldt deglycosylated hCGβ polypeptid (MW: 16 kDa). Andre bands kan stamme fra ufuldstændige deglycosylation eller fra flere uidentificerede proteiner til stede i hCGβ stikprøven (se bane 1). Lanes 5 til 7 (kontrol) viser de bands, der svarer til glycosidases.

Glykoprotein farvning af Emerald Green er vist i panelet B. Dette reagens oxideres og pletter alle glycans til stede i et protein molekyle. Derfor er intensiteten af ​​signalet falder som hCGβ enzymatisk er deglycosylated (lane 1 til bane 4). Den resterende signal i vognbaner 3 og 4 indikerer tilstedeværelsen af ​​glycan motiver, som er resistente over for de anvendte enzymer. De ekstra glycosidases anvendes i Lane 4 fjerne et par ekstra sukker rester: det protein migration er den samme, menen mindre reduktion i intensitet i farvning kan ses. Resistente sukker fragmenter var ikke til stede i alle protein arter: Nogle bands blev ikke opdaget af Emerald Green (fraværende i UV-billedet, i parentes), der angiver de blev udstrakt deglycosylated. Yderligere data understøtter den konklusion, at hCGβ uensartet er glykosyleret. Den nederste bånd på bane 2 (pil) er svag på Emerald grønne image, mens det øvre bånd på bane 2 er lyse, hvilket indikerer, at mange glycans grupper stadig er til stede. Disse data understøtter den konklusion, at rekombinant hCGβ udtrykt i mus celler indeholder flere glycoforms ^9. Disse forskellige glycoforms skyldes den iboende uensartethed glycosylation hvor nogle polypeptider ikke modtager glycan i hver konsensus stedet og / eller nogle glycans udvides, mens andre selv på samme protein ikke er.

Figur 1.Typiske glycosyleringsmønstre for udskilles eller celle-overflade glykoproteiner.

Figur 2. SDS-PAGE geler Viser enzymatisk deglycosylation af hCGβ. Panel A viser en Coomasie blå farvning mens Panel B viser resultaterne af Pro-Q Emerald 300 til visualisering af glykosyleret proteiner. Prøve nummer: 1, hCGβ kontrol; 2, PNGase F fordøjelsen, 3, Deglycosylation Mix fordøjelsen, 4, Deglycosylation Mix Plus exoglycosidases fordøjelse, prøver fra 5 til 7 er reagenset kontroller (O-Glyc, O-Glycosidase, GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Gal / FUC, β1-3 galactosidase, α1-3, 6 galactosidase, og α1-2 Fucosidase, GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase, Neu, neuraminidase, PNGase, PNGase F)

Discussion

Metoden beskrives her ved hjælp af enzymatisk deglycosylation og SDS-PAGE kan give værdifulde oplysninger om glykosylering tilstand af et protein af interesse, mens glycan-specifikke reagenser lette fortolkningen af ​​data. Denne protokol er beregnet til de indledende undersøgelser af protein glycosylation, og det er særligt velegnet til sekretorisk og membran glycoproteiner fra pattedyrceller: de enzymer, der er valgt i dette tilfælde vil specielt fjerne alle N-glycans, og eller N-glycans plus og de ​​mest almindelige sukker udvidelse og som udgør kernen i O-glycans. Glycosidases har den yderligere fordel af at være milde, sammenlignet med kemiske deglycosylation metoder, bevare integriteten af ​​både sukker og protein backbone.

For at belyse graden af ​​belægning (som aminosyrer er glykosyleret), omfanget af glykosylering, eller til at bestemme fine struktur glycans, mere sofistikerede teknikker som mrøv spektrometri, væskekromatografi eller NMR er påkrævet.

På grund af sin enkelhed, kan flere skridt i denne protokol justeres, erstattes, og / eller kombineres for at tilgodese forskellige eksperimentelle behov. Men for at opnå resultater, som klart kan tolkes, er det vigtigt at forstå sine styrker og begrænsninger. For det første specificitet og renheden af ​​glycosidases er afgørende: kun velkarakteriseret enzymer testet til at være fri for proteaser og andre forurenende aktiviteter bør anvendes. Desværre er der ingen standard enzymenhed definition glycosidases, at brugeren skal fastsætte en passende erstatning i henhold til producentens specifikationer. For det andet, et omhyggeligt valg af påvisning er nødvendige: a) Protein farvningsreagenser er kun nyttig, hvis deglycosylation resulterer i et markant skift i molekylær masse. En sådan et klart resultat, som vist her er ikke altid opnås. I andre tilfælde har vi set unormal migration efter deglycosylation (langt fra den forventede molekylvægt eller endnu langsommere migration). Dette fænomen er ikke godt forstået, men det kan siges, at enhver ændring i migration er bevis på, at protein er blevet deglycosylated. B) Sukker detektion med antistoffer præsenterer unikke udfordringer begrænser deres anvendelighed. Det har været meget vanskelige at uddrage generelle anti-glycan antistoffer, de er som regel rejst mod en kompleks glycan mål, som begrænser deres anvendelse. Desuden har flere monoklonale anti-glycan antistoffer display uønsket krydsreaktivitet ^10. C) lektiner (proteiner med iboende sukker affinitet) er velegnede for sukker detektion, plus de giver indsigt i glycan struktur. Men ikke alle af dem har en smal specificitet, og mange er kun delvist præget (hvilket betyder, at de kunne have ukendt tilhørsforhold). Som en konsekvens positiv lektin farvning giver indikation, der ikke bevis for tilstedeværelsen af ​​en giHven sukker. d) Kemisk mærkning kits (baseret på periodate oxidation af sukker) er den foretrukne metode til farvning af alle glycoproteiner, og dermed velegnet til at følge deglycosylation.

Ved behandling af en ukendt prøve, er det en god praksis at inkludere glykoprotein kontrol. Fetuin er en let tilgængelig N - og O-glycoprotein, choriongonadotropin (begge subunits) er også et godt valg. Bovin serum albumin (BSA) kan anvendes som negativ kontrol. Dog skal det bemærkes, at nogle ikke-glykosyleret proteiner reagerer let med Pro-Q Emerald 300, især når de anvendes ved høje koncentrationer. Ikke-glykosyleret molekylvægt standarder, såsom prestained protein markør anvendes i denne protokol, har den fordel at vise skarpe bands. Kun ved en tilfældighed er en af ​​disse proteiner (80 kDa) reaktiv til Pro-Q Emerald 300. Derfor kan brugeren ønsker at køre et glykoprotein standard stigen i stedet, som f.eks Candy-Cane fra InvitrogeN.

Endelig er enkel i-gel detektering af nucleocytosolic glycoproteiner (som er modificeret med en enkelt O-GlcNAc) er mulig ved brug af et monoklonalt antistof, langs β-N-Acetylglucosaminidase for specificitet kontrol ^11. Beskrivelsen af denne teknik er uden for rammerne af denne artikel, men det bør nævnes som glycosidases er nyttige værktøjer til studiet af mange andre glycoproteiner og glycoconjugates til stede i celler. En omfattende behandling af alle kendte former for glycosylation kan findes i den anden udgave af "Essentials of glycobiology" gratis tilgængelig online på NCBI Reol (Boghylde ID: NBK1908; PMID: 20301239) ^12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human chorionic gonadotropin β	Sigma-Aldrich	C6572
PCR Tubes	VWR international	20170-004
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	4359659
PNGase F	New England Biolabs	P0704	Supplied with buffers
Protein Deglycosylation Mix	New England Biolabs	P6039	Supplied with buffers
α-N-Acetylglalactosaminidase	New England Biolabs	P0734	Supplied with buffer
α1-2 Fucosidase	New England Biolabs	P0724	Supplied with buffer
α1-3,6 Galactosidase	New England Biolabs	P0731	Supplied with buffer
β1-3 Galactosidase	New England Biolabs	P0726	Supplied with buffer
10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate)	New England Biolabs	---	Supplied with PNGaseF or Degl Mix
10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT)	New England Biolabs	---	Supplied with PNGaseF or Degl Mix
10% NP-40	New England Biolabs	---	Supplied with PNGaseF or Degl Mix
3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue)	New England Biolabs	B7703	Supplied with 1.25M DTT
ColorPlus Prestained Protein Marker	New England Biolabs	P7709
10-20% Tris-Glycine Multigel	Cosmo Bio Co.	DCB-414893
Cassette Electrophoresis Unit	Cosmo Bio Co.	DCB-303111
Electrophoresis Power Supply EPS 301	GE Healthcare	18-1130-01
Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit	Invitrogen	P-21857
Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B0149
AlphaImager HP System	Cell Biosciences	92-13823-00